《一種藥物組合物及其製備方法》是昆明製藥集團股份有限公司於2009年9月24日申請的發明專利，該專利申請號為200910175602X，公布號為CN102028700A，公布日為2011年4月27日，發明人是張國麗、王子幼、楊兆祥。
《一種藥物組合物及其製備方法》提供一種藥物組合物，其組份包括：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rc、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg3。該發明還提供所述藥物組合物的製備方法。該發明所述藥物組合物成分明確，與2009年9月前相關技術的三七總皂苷相比質量穩定、可控性好，急性毒性、異常毒性、溶血等試驗結果表明，該發明所述藥物組合物安全性更高，具有廣泛的臨床套用前景。
2021年6月24日，《一種藥物組合物及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種藥物組合物及其製備方法
- 申請人：昆明製藥集團股份有限公司
- 發明人：張國麗、王子幼、楊兆祥
- 申請號：200910175602X
- 申請日：2009年9月24日
- 公布號：CN102028700A
- 公布日：2011年4月27日
- 地址：雲南省昆明市高新技術產業開發區科醫路166號
- 代理機構：北京集佳智慧財產權代理有限公司
- 代理人：逯長明
- Int. Cl.：A61K31/704; A61K33/14; A61K31/195; A61P9/10; A61P9/12; A61P3/06; A61P7/02
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,專利榮譽,
專利背景
三七與人參、西洋參同屬五加科人參屬，三者均為名貴中藥材。2009年9月前對三七與人參的化學成分研究表明，三七皂苷與人參皂苷近似，均以達瑪烷型皂苷為主，但三七的總皂苷含量高，在皂苷組成方面有意義的人參皂苷Rb1和Rg1均高於人參。
皂苷是三七主要活性成分之一，此外，還含止血有效成分三七素，以及多糖、胺基酸、揮髮油、黃酮及微量元素等。從三七中提取分離得到的單體皂苷有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、三七皂苷R1、R2、R4等，三七中的不同皂苷其藥理作用各不相同，各組份間有的具有協同增效作用，有的起拮抗作用，從而使三七總皂苷表現出的藥理作用很獨特。《一種藥物組合物及其製備方法》多組份組合物三七總皂苷含有可定量的十個組份外，還含其它多種組份，因此，也應具有廣泛的藥理作用。從三七總皂苷的藥理文獻資料可知其具有以下各方面的藥理作用：
1.對心血管系統的作用
（1）對心臟的作用：人參皂苷Rb1和人參皂苷Re均可減少缺血再灌注心肌細胞的凋亡，而人參皂苷Rb1的效果優於人參皂苷Re；人參皂苷Re對心肌缺血造成的心臟損害，有顯著的保護作用；人參皂苷Rb1可能具有抑制缺血再灌注心肌細胞凋亡的作用，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。另有報導三七皂苷能擴張冠脈，增加冠脈血流量，三七總皂苷能增加心肌營養血流量，改善心肌微循環，明顯降低心肌耗氧量；三七總皂苷還被證明是三七治療缺血性心臟病的基礎。
（2）對血管、血壓的作用：人參二醇組皂苷可致血壓明顯下降，三醇組皂苷可引起血壓升高。據報告，人參皂苷Re及Rg1對狗血管呈擴張作用，Rb2、Rc僅有微弱血管擴張，認為Rg1引起降壓前的升壓作用最大。三七有擴張血管、降低血壓作用，2009年9月前普遍認為三七總皂苷是鈣通道阻滯劑。同時，三七能擴張腦血管，降低腦血管阻力，增加腦血流量，改善腦血循環，對腦缺血損傷有保護作用。
（3）抗休克作用：人參二醇組皂苷能抑制血管緊張素轉化酶的活性，改善微循環，增加有效循環血量，提高休克犬的存活率。人參三醇皂苷具有抗休克作用，快速改善心肌缺血和缺氧，治療和預防冠心病。三七總皂苷能降低耗氧量和抗實驗性心肌缺血提示其可能具有抗休克和改善休克時心功能障礙的作用；三七總皂苷對兔失血性休克及腸道缺血性休克具有一定療效。
（4）抗心律失常：人參二醇組皂苷能降低離體大鼠右心房的自律性，在治療量時對多種模型的心律失常均有明顯的對抗作用。三七總皂苷對幾種實驗性心律失常模型（氯仿誘發的小鼠心室纖顫、氯化鋇和烏頭鹼誘發的心律失常）均有明顯對抗作用。還有實驗證明三七中人參三醇苷對整體大鼠結紮冠脈誘發心肌缺血及再灌注損傷所致心律失常具有明顯的抑制作用。
2.對血液和造血系統的影響
現代藥理學研究表明三七不但具有良好的止血、活血化瘀雙向藥理作用，還具有明顯的補血作用，能促進血液中紅細胞、白細胞、血小板等各類血液細胞分裂生長，增加數目，並保持正常水平。三七總皂苷對家兔、大白鼠實驗性血栓形成均有明顯抑制作用；靜脈注射可以明顯抑制凝血所致瀰漫性血管內凝血、動物血小板數目的下降和纖維蛋白降解產物的增加。三七總皂苷還可明顯降低冠心病患者的血小板黏附和聚集，亦可改善微循環，抗血栓形成。
3.對中樞神經系統的作用
人參皂苷Rg類有中樞興奮作用，Rb類呈鎮靜作用；Rg1與學習過程有關，而Rb1與記憶和安定作用有關。
（1）益智作用：三七皂苷Rg1和Rb1能顯著增強小鼠的學習和記憶能力，對亞硝酸鈉及40％乙醇造成的小鼠記憶不良均有不同程度的對抗作用。
（2）鎮靜、鎮痛作用：三七總皂苷、三七單體Rb1均有顯著的鎮靜作用，並能協同中樞抑制藥的抑制作用，同時，對化學性和熱刺激性引起的疼痛均有明顯的鎮痛作用。
（3）對神經細胞的作用：人參皂苷Rb1對缺血性腦損傷有保護作用，但並不呈劑量依賴性；實驗發現低濃度人參皂苷Rb1對誘導細胞增殖有明顯促進作用，高濃度則顯示抑制作用。實驗觀察三七總皂苷對模型細胞的保護作用，發現三七總皂苷對能量代謝障礙引起的神經細胞損傷有保護作用。人參皂苷Rb1可能是三七對神經細胞起保護作用的主成分之一。
對腦出血受損神經元的保護作用，對腦缺血性損傷的保護作用，對脊髓損傷後的保護作用，對老年性痴呆病理損害的保護作用。
4.對免疫系統的作用：有研究表明人參皂苷Rg3在體外能明顯增強自然殺傷（NK）細胞的吞噬活性，而NK細胞的吞噬功能屬於機體非特異性免疫功能；人參皂苷Rb1可以增強體液免疫。
5.抗衰老作用：三七總皂苷具有抗衰老、預防動脈硬化的作用，其中二醇型皂苷具有清除氧自由基的作用，而人參皂苷Rg1則通過抗氧化作用和抑制胞內鈣超載，從而抑制神經細胞凋亡和前炎因子增多，延緩衰老。
6.抗腫瘤作用：三七總皂苷可通過直接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長或轉移、誘導腫瘤細胞凋亡或誘導腫瘤細胞分化使其逆轉、增強和刺激機體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤作用。另外，人參皂苷Rg3、Rh2的抗癌作用也有相關報導。
7.對糖代謝的影響：三七皂苷有升高或降低血糖的作用，且三七皂苷對血糖的影響取決於動物狀態及機體血糖水平，因而具有自動雙向調節血糖的功能。
8.促進視網膜節細胞再生。
9.抗纖維化：抗肝纖維化，抗肺纖維化，防治腎間質纖維化。
10.抗炎作用：對多種實驗性炎症模型有良好的抗炎活性。
2009年3月25日公開的發明專利“三七總皂苷的藥物組合物”，該發明申請保護的組合物以三七中的五個主要皂苷成分：人參皂苷Rb1、Rg1、Rd、Re及三七皂苷R1為基礎，再組合人參皂苷Rb2或Rb3或Rb2和Rb3。專利中還說明了組合物的製備方法，該發明採用的是先分離提純各組份，再將它們混合的方法，這不僅棄去了許多有效成分，還使其製備成本相當高。
另外，2009年9月前相關技術的三七總皂苷含有的可定量組份為5個，總含量為65％~80％，還含有相當比例的未知雜質，這些雜質的藥物間相互作用不明確，從而在臨床的質量控制及套用方面帶來諸多問題，增加了不良反應如皮膚過敏、寒戰、丘疹、心悸、氣短等的發生機率。
發明內容
專利目的
《一種藥物組合物及其製備方法》的目的是克服相關技術中的三七總皂苷雜質含量高、副作用多的缺陷，提供一種藥物組合物，其有效成分含量可定量，可定量的皂苷組份、氯化鈉及總胺基酸的總含量大於90％，質量穩定可控，安全性高。
技術方案
一種藥物組合物，其組份包括：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rc、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg3。
所述藥物組合物各組分優選的重量百分比為：人參皂苷Rb1占30.0％~40.0％；人參皂苷Rg1占25.0％~35.0％；三七皂苷R1占7.0％~15.0％；人參皂苷Rd占7.0％~10.0％；人參皂苷Re占4.0％~7.0％；人參皂苷Rf占0.3％~2.0％；人參皂苷Rc占0.5％~2.0％；人參皂苷Rh1占0.5％~3.0％；人參皂苷Rb2占0.5％~3.0％；人參皂苷Rg占30.5％~2.0％。
優選地，《一種藥物組合物及其製備方法》藥物組合物還有重量百分比為0.1％-1.0％的氯化鈉。
更優選地，《一種藥物組合物及其製備方法》藥物組合物還含有重量百分比為0.2％-1.2％的總胺基酸。
《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物經過常規加工直接或間接加入藥學上可接受的輔料製成注射液、凍乾粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、滴丸、合劑、糖漿劑。
在《一種藥物組合物及其製備方法》的實施例中，具體提供一種三七總皂苷注射劑及其製備方法，該注射劑與相關的三七總皂苷注射劑相比，結構明確組份增加、結構明確組份含量明顯提高、質量更穩定可控、安全性更好。
《一種藥物組合物及其製備方法》還提供所述組合物在製備治療冠心病、腦卒中、心絞痛、高血壓、高血脂、視網膜中央靜脈栓塞的藥物中的套用。
為了克服2009年9月前相關技術製備方法複雜且成本高的缺陷，《一種藥物組合物及其製備方法》還提供所述藥物組合物的製備方法，包含以下步驟：
步驟1：三七用60％-85％乙醇浸潤，磨碎成粗粉，加乙醇回流提取2~4次，每次0.5~2小時，收集提取液，過濾；
步驟2：取濾液回收乙醇，上大孔吸附樹脂柱，依次用水和60％~80％的乙醇液洗脫，將醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，60％~80％乙醇液洗脫，將洗脫液減壓濃縮，上三氧化二鋁柱，70％-80％乙醇洗脫，將洗脫液濃縮；
步驟3：將步驟2所得濃縮液再用丙酮重結晶精製，乾燥，即得《一種藥物組合物及其製備方法》所述三七總皂苷。
優選地，步驟1回流步驟所用乙醇濃度為60％~85％。
優選地，步驟1回流步驟所用乙醇用量為三七重量的5~13倍。
藥材來源，五加科植物三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）的乾燥根及根莖。《一種藥物組合物及其製備方法》所述方法製備的藥物組合物，其有效成分含量可定量，可定量皂苷組份、氯化鈉及總胺基酸的總含量大於90％，質量穩定，可控性增強，安全性提高。
《一種藥物組合物及其製備方法》對三七中的皂苷部分進行整體的提取分離，在去除雜質的同時儘量保留較多的有效成分，以及調整提取物中主要皂苷組份的比例，採用丙酮精製步驟使主要成分保持人參皂苷Rb1的含量比人參皂苷Rg1高5％~10％，在保證藥效的同時使二者在不良反應方面有互相抑制作用。
改善效果
與市售的三七總皂苷相比，《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的優點在於：
1.經毒理、藥理實驗證明，最大耐受量與半數致死劑量均明顯提高；
2.還具有提高衰老狀態下內源性抗氧化酶活性，清除體內氧自由基，提高機體的免疫功能的作用；
3.改善缺血心肌的血流動力學功能以及心肌缺氧耐受功能；
4.可降低MDA含量、提高SOD活力，減輕自由基反應對腦組織的損害，對缺血腦組織發揮保護作用；
5.《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物中人參皂苷Rb1與人參皂苷Rg1的比例即可保證藥效的發揮，又能避免溶血不良反應的發生。
技術領域
《一種藥物組合物及其製備方法》涉及醫藥領域，具體涉及一種藥物組合物及其製備方法。
權利要求
1.一種藥物組合物，其組份包括：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rc、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg3、氯化鈉、總胺基酸；所述組分的重量百分比為：人參皂苷Rb1占30.0%~40.0%；人參皂苷Rg1占25.0%~35.0%；三七皂苷R1占7.0%~15.0%；人參皂苷Rd占7.0%~10.0%；人參皂苷Re占4.0%~7.0%；人參皂苷Rf占0.3%~2.0%；人參皂苷Rc占0.5%~2.0%；人參皂苷Rh1占0.5%~3.0%；人參皂苷Rb2占0.5%~3.0%；人參皂苷Rg3占0.5%~2.0%；0.1%~1.0%的氯化鈉和0.2%~1.2%的總胺基酸；且人參皂苷Rb1含量比人參皂苷Rg1含量高5%~10%；所述藥物組合物的製備方法，包含以下步驟：步驟1：三七用60%-85%乙醇浸潤，磨碎成粗粉，加乙醇回流提取2~4次，每次0.5~2小時，收集提取液，過濾；步驟2：取濾液回收乙醇，上大孔吸附樹脂柱，依次用水和60%~80%的乙醇液洗脫，將醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，60%~80%乙醇液洗脫，將洗脫液減壓濃縮，上三氧化二鋁柱，70%-80%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮；步驟3：將步驟2所得濃縮液再用丙酮重結晶精製，乾燥，即得。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物經過常規加工直接或間接加入藥學上可接受的輔料製成注射液、凍乾粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、滴丸、合劑、糖漿劑。
3.權利要求1~2任一項所述藥物組合物在製備治療冠心病、腦卒中、心絞痛、高血壓、高血脂、視網膜中央靜脈栓塞的藥物中的套用。
4.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，步驟1回流步驟所用乙醇濃度為60%~85%。
5.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，步驟1回流步驟所用乙醇用量為三七粗粉重量的5~13倍。
實施方式
實施例1：製備《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物
稱取三七10公斤，用重量比1倍量的60~85％乙醇浸潤、泡軟，濕法磨碎成粗粉，分別加乾藥材重量5、6、6倍的70％乙醇，回流提取3次，每次1小時，收集提取液，過濾。取濾液回收乙醇至無醇味，加水製成每1毫升含0.5克生藥的溶液，上大孔吸附樹脂柱，分別用水、70％乙醇液洗脫，醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，70％乙醇液洗脫，收集乙醇洗脫部分，減壓濃縮，洗脫液濃縮，上三氧化二鋁柱，85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮。再以丙酮重結晶精製，乾燥，得《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物。
有效成分含量測定：對照提取物溶液的製備：精密稱取在60攝氏度減壓乾燥2小時的三七總皂苷對照提取物適量，加70％甲醇溶解，製成每1毫升含2.5毫克的溶液，即得。
供試品溶液的製備：精密稱取本品適量，加70％甲醇溶解並稀釋成每1毫升含三七總皂苷2.5毫克的溶液，即得。
測定法：分別精密吸取對照提取物溶液與供試品溶液各10微升，注入液相色譜儀，測定，即得。
色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表中的規定進行梯度洗脫；流速為每分鐘1.0毫升（4.6×150毫米，5微米）或1.5毫升（4.6×250毫米，5微米）；檢測波長為203納米；柱溫25攝氏度。人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度應大於1.5，理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低於6000。
時間（分鐘） | 流動相A（%） | 流動相B（%） |
|---|---|---|
0-20 | 20→22 | 80→78 |
20-45 | 22→46 | 78→54 |
45-55 | 46→55 | 54→45 |
55-60 | 55 | 45 |
柱再生與平衡 | ||
60-62 | 55→90 | 45→10 |
62-70 | 90 | 10 |
70-73 | 90→20 | 10→80 |
73-90 | 20 | 80 |
90 | 20 | 80 |
氯化鈉測定方法：按GB/T 5009.40-2003方法，採用電漿發射光譜儀測定。
胺基酸測定方法：按GB/T 5009.124-2003方法，採用胺基酸分析儀測定。
結果：各組份含量為：人參皂苷Rb1：34.1％，人參皂苷Rg1：28.6％，三七皂苷R1：9.1％，人參皂苷Rd：7.2％，人參皂苷Re：5.1％，人參皂苷Rh1：1.7％，人參皂苷Rc：1.2％，人參皂苷Rg3：1.2％，人參皂苷Rb2：1.1％，人參皂苷Rf：0.9％，氯化鈉：0.6％，胺基酸：0.9％，上述各組份總含量為91.7％。
實施例2：製備《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物
稱取三七10公斤，用重量比1倍量的60~85％乙醇浸潤、泡軟，濕法磨碎成粗粉，加重量為藥材重量8、10、10倍的80％乙醇，回流提取3次，每次1小時，收集提取液，過濾。取濾液回收乙醇至無醇味，加水製成每1毫升含0.5克生藥的溶液，上大孔吸附樹脂柱，分別用水、75％乙醇液洗脫，醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，75％乙醇液洗脫，收集乙醇洗脫部分，減壓濃縮，洗脫液濃縮，上三氧化二鋁柱，80％乙醇洗脫，洗脫液濃縮。再以丙酮重結晶精製，乾燥，得《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物。
有效成分含量測定方法、條件同實施例1。
結果：各組份含量為：人參皂苷Rb1：36.5％，人參皂苷Rg1：27.3％，三七皂苷R1：8.9％，人參皂苷Rd：9.7％，人參皂苷Re：4.9％，人參皂苷Rh1：2.0％，人參皂苷Rc：1.6％，人參皂苷Rg3：1.3％，人參皂苷Rb2：1.0％，人參皂苷Rf：0.8％，氯化鈉：0.5％，胺基酸：0.8％上述各組份總含量為95.3％。
實施例3：製備《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物
稱取三七10公斤，用重量比1倍量的85％乙醇浸潤、泡軟，濕法磨碎成粗粉，每次加重量為乾藥材重量13倍的85％乙醇，回流提取4次，每次2小時，收集提取液，過濾。取濾液回收乙醇至無醇味，加水製成每1毫升含0.5克生藥的溶液，上大孔吸附樹脂柱，分別用水、80％乙醇液洗脫，醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，80％乙醇液洗脫，收集乙醇洗脫部分，減壓濃縮，洗脫液濃縮，上三氧化二鋁柱，80％乙醇洗脫，洗脫液濃縮。再以丙酮重結晶精製，乾燥，得《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物。
有效成分含量測定方法、條件同實施例1。
結果：各組份含量為：人參皂苷Rb1：40.0％，人參皂苷Rg1：35.0％，三七皂苷R1：7.0％，人參皂苷Rd：7.0％，人參皂苷Re：4.0％，人參皂苷Rh1：0.5％，人參皂苷Rc：0.5％，人參皂苷Rg3：0.5％，人參皂苷Rb2：0.5％，人參皂苷Rf：0.3％，氯化鈉：0.1％，胺基酸：0.2％。上述各組份總含量為95.6％。
實施例4：製備《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物
稱取三七10公斤，用重量比1倍量的60％乙醇浸潤、泡軟，濕法磨碎成粗粉，每次加乾藥材重量5倍的80％乙醇，回流提取2次，每次0.5小時，收集提取液，過濾。取濾液回收乙醇至無醇味，加水製成每1毫升含0.5克生藥的溶液，上大孔吸附樹脂柱，分別用水、60％乙醇液洗脫，醇洗脫液濃縮，再上大孔離子交換樹脂柱，60％乙醇液洗脫，收集乙醇洗脫部分，減壓濃縮，洗脫液濃縮，上三氧化二鋁柱，70％乙醇洗脫，洗脫液濃縮。再以丙酮重結晶精製，乾燥，得《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物。
有效成分含量測定方法、條件同實施例1。
結果：各組份含量為：人參皂苷Rb1：30.0％，人參皂苷Rg1：25.0％，三七皂苷R1：15.0％，人參皂苷Rd：10.0％，人參皂苷Re：7.0％，人參皂苷Rh1：3.0％，人參皂苷Rc：2.0％，人參皂苷Rg3：2.0％，人參皂苷Rb2：3.0％，人參皂苷Rf：1.0％，氯化鈉：1.0％，胺基酸：0.2％。上述各組份總含量為99.2％。
實施例5：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物注射液的製備
取實施例1所得藥物組合物，加配製量30~50％注射用水，充分攪拌使溶解完全，加入適量針用活性炭，先用包有濾紙的砂棒粗濾，冷藏過濾，加水至總量，加入適量針用活性炭吸附，用0.1摩爾/升氫氧化鈉調pH值至6.0~7.0，濾液經0.45微米微孔濾膜過濾，取樣檢驗pH值及含量等項。用0.2微米孔徑過濾器精濾，灌裝，熔封，滅菌即得。
有效成分含量測定方法、條件同實施例1。
結果：各成分含量為人參皂苷Rb1：33.5％，人參皂苷Rg1：28.5％，三七皂苷R1：9.0％，人參皂苷Rd：7.9％，人參皂苷Re：5.2％，人參皂苷Rh1：1.5％，人參皂苷Rc：1.0％，人參皂苷Rg3：1.1％，人參皂苷Rb2：1.0％，人參皂苷Rf：0.6％，氯化鈉：0.6％，胺基酸：0.9％，上述各組份總含量為90.8％。
實施例6：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物注射用凍乾粉針劑的製備
取實施例2所得藥物組合物，加新鮮注射用水適量，充分攪拌使溶解完全，使三七總皂苷濃度約為10％。加入適量氯化鈉，充分攪拌使溶解，再加入與氯化鈉等量的甘露醇，充分攪拌使溶解完全。加入適量針用活性炭，攪拌吸附30分鐘，先用包有濾紙的砂棒過濾除去活性炭，濾液再經0.45微米微孔濾膜過濾。取樣檢驗pH值及含量等項。總配藥液用0.1摩爾/升氫氧化鈉調pH值至6.0~7.0，用0.2微米孔徑過濾器精濾，灌裝，冷凍乾燥，壓塞，軋蓋，即得。
有效成分含量測定方法、條件同實施例1。
結果：各成分含量為人參皂苷Rb1：36.8％，人參皂苷Rg1：27.5％，三七皂苷R1：9.1％，人參皂苷Rd：9.2％，人參皂苷Re：5.1％，人參皂苷Rh1：2.0％，人參皂苷Rc：1.1％，人參皂苷Rg3：1.1％，人參皂苷Rb2：1.0％，人參皂苷Rf：0.8％，氯化鈉：0.6％，胺基酸：0.8％，上述各組份總含量為95.1％。
實施例7：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的藥效學研究
1、對心肌缺血大鼠血流動力學的影響
實驗動物：選用Wistar大鼠60隻，雄性，體質量250~300克。
藥物與試劑：實施例1樣品，三七總皂苷（市售）；0.9％氯化鈉注射液、戊巴比妥鈉注射液。
儀器：MP-100多導生理記錄儀、電子分析天平。
造模：大鼠給3％戊巴比妥鈉（30毫克/千克）腹腔注射麻醉，將大鼠仰位固定於自製鼠板上；胸部剪毛，將心電圖電極針埋在左下肢及右上肢皮下，沿左側第7肋間剪開皮膚，少量剝離胸肌，剪開心包，將心臟輕輕擠壓出胸壁外，分離左冠狀動脈前降支（LAD），在離LAD起始部2毫米處穿線（用穿有5-0縫合線的3/8彎針鉤）後，把心臟迅速放回胸腔，術後穩定10分鐘左右，結紮冠狀動脈，立即做心電圖，進行記錄並縫合。心電圖顯示ST段顯著抬高或異常T波時；即表明急性心肌缺血造模成功。30隻大鼠完成了該實驗，實驗中有20隻大鼠因手術死亡或結紮後心電圖沒有明顯變化（心電圖II導聯ST段沒有抬高）退出研究。
實驗分組：將急性心肌缺血模型大鼠30隻；隨機分為模型組、實施例1組、市售三七總皂苷組，共3組；另將10隻未造模的同齡大鼠作為假手術組。
觀察方法：給藥組按60毫克/千克·天灌服，假手術組及模型組灌服等量生理鹽水，共7天。各組分別治療至時間終點；再次戊巴比妥鈉腹腔麻醉。首先靜脈推注肝素全身抗凝；手術分離股動脈和右頸總動脈。後套用十六導生理記錄儀檢測心臟血流動力學參數。股動脈插管記錄動脈收縮壓（SBP）和動脈舒張壓（DBP），右頸總動脈插管至左心室記錄壓力曲線；記錄心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室最大收縮（+）和舒張（-）速率（±dp/dt max），結果見表2。
結果：模型大鼠心電圖的影響結紮大鼠冠脈前降支後，各組S-T段明顯抬高，與假手術組相比，P＜0.05，但各組間無明顯差異。3小時後S-T段下降，下降的波幅度以實施例1組明顯，但與模型組比較無統計學差異。見表1。
表1為各組心電圖S-T段變化波幅比較（
，毫伏）。
組別 | n | 結紮後 | △S-T |
|---|---|---|---|
假手術組 | 10 | 0±0 | 0±0 |
模型組 | 10 | 0.341±0.066 | 0.052±0.028 |
實施例1組 | 10 | 0.407±0.113 | 0.062±0.037 |
市售注射液組 | 10 | 0.298±0.097 | 0.054±0.022 |
註：與假手術組相比，P＜0.05，△S-T＝結紮後3小時下降幅度。
表1結果表明，模型組的左室舒張末期壓（LVEDP）明顯高於假手術組，兩組比較有統計學差異，P＜0.05；各給藥組的LVEDP明顯低於模型組，與模型組比較有統計學差異，P＜0.05。
參數 | 假手術組 | 模型組 | 實施例1組 | 市售三七總皂苷 |
|---|---|---|---|---|
SBP（毫米汞柱） | 126.92±10.63 | 84.64±12.47 | 112.45±14.05 | 111.13±12.87 |
DBP（毫米汞柱） | 84.65±8.35 | 67.03±10.56 | 90.84±15.01 | 89.87±15.14 |
LVSP（毫米汞柱） | 147.81±14.94 | 108.63±11.63 | 118.16±13.12 | 121.60±13.55 |
LVEDP（毫米汞柱） | -12.12±2.15 | 6.06±1.50 | 3.96±1.90 | 5.57±1.89 |
+dp/dt max（毫米汞柱/秒） | 4495.10±360.40 | 2005.50±269.30 | 2857.80±436.9 | 2643.30±376.80 |
-dp/dt max（毫米汞柱/秒） | 3679.00±322.60 | 1617.60±187.90 | 2355.90±518.4 | 1773.50±212.30 |
HR（拍/分鐘） | 523.33±41.03 | 439.76±57.16 | 493.84±32.98 | 483.87±31.78 |
表2結果表明：模型組±dp/dt max明顯低於假手術組，兩組比較有統計學差異，P＜0.05，實施例組±dp/dt max明顯高於模型組、LVEDP明顯低於模型組，與模型組相比較有統計學差異，P＜0.05，市售三七總皂苷組±dp/dt max高於模型組，與模型組比較有統計學差異，P＜0.05，提示可提高心室壁順應性，改善心臟功能。HR等參數各組比較無統計學差異。
該實驗顯示，模型組與假手術組相比，±dp/dt max降低、LVEDP升高，這與梗死後心臟前負荷增加有關。同時給藥組均能在一定程度上改善左室收縮及舒張功能，其中實施例1組作用最明顯。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行心肌缺血大鼠血流動力學的影響試驗，結果表明，與實施例1的樣品的結果相似，組間差別無統計學意義。
實施例8：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
實驗動物：健康Wistar大鼠40隻，雌雄兼用，體重280~320克。按性別、體重，隨機分為4組（10隻/組），每組雌雄比例接近，即假手術組、模型組、尼莫地平對照（Nim）組、實施例2樣品組。
造模：取5厘米長3.0號釣魚用單尼龍線，頭端快速加熱使之成光滑球面，在距頭端18毫米處作標記，置肝素生理鹽水中浸泡備用。以10％水合氯醛（350毫克/千克）腹腔注射（ip）麻醉，頸部正中切開，鈍性分離至頸前肌，於右側頸前肌旁分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），沿ICA分離結紮翼齶動脈（PPA），分離過程中電凝血管小分支以防出血，結紮並切斷ECA兩分支枕動脈、甲狀腺上動脈，結紮並分離ECA主幹一段，用動脈夾暫時阻斷CCA和ICA血流，輕輕向下拉ECA殘端，在ECA近CCA交界處剪一小切口，將製備好的尼龍線栓子經ECA切口緩慢向ICA入顱方向推進，以CCA分叉處為標記，尼龍線插入深度距分叉處（18.5±0.5）毫米，即阻斷大腦中動脈。術畢縫合皮下組織和皮膚，外留1厘米長尼龍線頭。阻斷2小時後，輕輕提拉所留線頭至有阻力時，提示尼龍線頭端已至頸外動脈殘端，血流再通，再灌注24小時，假手術組除不插尼龍線外其餘步驟同上。
給藥方法：各組於缺血前5分鐘第一次ip給藥，以後每隔12小時給藥1次，共給藥4次，實施例2組以三七總皂苷計給藥劑量為25毫克/千克，尼莫地平注射液給藥劑量為1毫克/千克，均為臨床等效劑量；假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。
指標測定：
（1）腦梗死灶測量缺血再灌注實驗末取出鼠腦，冠狀面均勻切成2毫米厚腦組織片5~6片，置於2％TTC磷酸緩衝液37攝氏度浸染10分鐘。正常腦組織染成紅色、缺血區呈灰白色，境界清晰。將各腦切片置於玻璃平板與掃描平板之間，套用掃瞄器進行圖像採集，然後用計算機圖像分析系統測量每個切片的面積、腦梗死面積（TTC不著色區），計算腦梗死占每片腦面積百分比。亦可分離梗死組織與正常組織，分別稱重，計算梗死組織占每片濕重的百分率。
（2）腦組織含水量於缺血2小時再灌注24小時末快速取出鼠腦，將梗死側腦用濾紙吸乾表面水分稱重後，置160攝氏度烤箱中烘乾至恆重，按下式計算腦組織含水量：含水量＝（濕重-乾重）/濕重×100％。
（3）腦組織MDA含量、SOD活性測定缺血再灌注實驗末快速斷頭取腦，用冰生理鹽水製成10％的勻漿，3000轉/分鐘離心15分鐘取上清液，全部分離過程在0~4攝氏度下進行。測定MDA含量、SOD活性。採用硫代巴比妥酸鹽法測定MDA含量，鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性，考馬斯亮蘭法測定上清液蛋白含量，按試劑盒說明書操作進行。
結果：
（1）腦梗死灶測量及腦組織含水量
模型組與假手術組比較，腦組織含水量顯著增加（P＜0.01）；實施例2組與模型組比較，腦組織含水量減少（P＜0.01），腦梗死面積顯著減小（P＜0.05）。結果見表3。
表3為腦組織含水量及梗死範圍（n＝10，）。
組別 | n | 腦含水量（％） | 腦梗死範圍（％） |
|---|---|---|---|
假手術組 | 10 | 75.02±0.51 | 0 |
模型組 | 10 | 83.20±0.33▲▲ | 30.62±3.2 |
Nim組 | 10 | 76.85±20.01** | 14.43±0.32** |
實施例2組 | 10 | 76.05±0.15** | 17.42±5.02* |
註：與假手術組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
（2）腦細胞SOD活力及MDA含量的變化
模型組與假手術組比較，SOD活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；實施例2組與模型組比較，SOD活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。見表4。
表4為腦細胞SOD活力及MDA含量（n＝10，）。
組別 | n | SOD（NUPmg·prot） | MDA（nmolPmg·prot） |
|---|---|---|---|
假手術組 | 10 | 288.01±23.81 | 4.43±0.17 |
模型組 | 10 | 105.20±10.03▲▲ | 12.82±0.21▲▲ |
Nim組 | 10 | 142.35±20.01** | 8.63±1.02* |
實施例2組 | 10 | 122.85±25.12* | 6.02±1.02* |
該研究結果顯示，模型組與假手術組比較，腦組織含水量顯著增加（P＜0.01）；實施例2組與模型組比較，腦組織含水量減少（P＜0.01），腦梗死面積顯著減小（P＜0.05），提示實施例2樣品對局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用。該研究結果顯示，模型組與假手術組比較，SOD活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；實施例1組與模型組比較，SOD活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。提示實施例2樣品可降低MDA含量、提高SOD活力，減輕自由基反應對腦組織的損害，對缺血腦組織發揮保護作用。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用試驗，結果表明，與實施例2的樣品的結果相似的，組間差別無統計學意義。
實施例9：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的抗衰老作用
實驗分組：選取2月齡左右，體重（200±20）克，清潔級SD健康大鼠36隻，雌雄各半。將實驗大鼠隨機分成3組，即青年對照組、衰老模型組、實施例3組，每組12隻。
動物模型的建立：將大鼠適應性餵養1周后，衰老模型組、實施例3組皮下注射25％的D-半乳糖溶液125毫克/千克/天，連續40天；青年對照組每日皮下注射等劑量0.9％生理鹽水1次，連續40天。
實驗方法：取實施例3樣品適量加蒸餾水至100毫升，用力振搖溶解，每1毫升溶液含三七總皂苷12毫克。
給藥方法：實施例3組在造模同時給予實施例3樣品溶液，每隻大鼠按成年人每日劑量的20倍灌胃給藥，連續40天。青年對照組和衰老模型組在相同條件下每日均餵普通飼料，自由攝食。
標本採集：將大鼠固定好，剪開腹股溝動脈處皮毛，局部消毒，分離並剪斷腹股溝動脈，血全部放入塑膠離心管中，4攝氏度以3000轉/分鐘離心10分鐘，吸取血清用於IL-2、IL-6含量及SOD活性、MDA含量測定。採血後，斷頸處死大鼠，立即剖腹取出肝臟，剝離乾淨，生理鹽水沖洗，濾紙吸乾，液氮凍存（-196攝氏度）備用，用於測定線粒體DNA含量。
指標及測定方法：肝細胞mtDNA相對含量測定（SDS鹼變性法檢測）。血清SOD活性測定（採用黃嘌呤氧化酶法測定），血清MDA含量測定（採用硫代巴比妥酸顯色法測定），試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。血清IL-2含量測定（用ELISA法），血清IL-6含量測定（用ELISA法），試劑盒均由深圳晶美生物工程有限公司提供。
結果：
（1）各組肝細胞mtDNA相對含量比較
造模40天后，衰老模型組與青年對照組比較，肝細胞mtDNA相對含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.05）；實施例3組與衰老模型組比較，肝細胞mtDNA相對含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表5。
表5為各組肝細胞mtDNA相對含量比較（）。
組別 | n | 肝細胞mtDNA |
|---|---|---|
青年對照組 | 12 | 1.0750±0.29617 |
衰老模型組 | 12 | 4.1900±0.53711* |
實施例3組 | 12 | 3.2650±1.00865△ |
註：與青年對照組相比，*P＜0.05；與衰老模型組相比，△P＜0.05。
（2）各組血清SOD活性、MDA含量比較
造模40天后，衰老模型組與青年對照組比較，血清SOD活性明顯降低，血清MDA含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.05）；實施例3組與衰老模型組比較，血清SOD活性明顯升高，血清MDA含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表6。
表6為各組血清SOD活性、MDA含量比較（）。
組別 | n | SOD活性 | MDA含量 |
|---|---|---|---|
青年對照組 | 12 | 596.0950±45.49180 | 7.9325±0.60035 |
衰老模型組 | 12 | 286.0558±20.22536* | 12.1567±0.89567* |
實施例3組 | 12 | 349.1708±77.23740△ | 11.2050±1.22207△ |
註：與青年對照組相比，*P＜0.05；與衰老模型組相比，△P＜0.05。
（3）各組血清IL-2、IL-6含量比較
造模40天后，衰老模型組與青年對照組比較，血清IL-2含量明顯降低，血清IL-6含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.05）；實施例3組與衰老模型組比較，血清IL-2含量明顯升高，血清IL-6含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表7。
表7為各組血清IL-2、IL-6含量比較（）。
組別 | n | IL-2（納克/毫升） | IL-6（皮克/毫升） |
|---|---|---|---|
青年對照組 | 12 | 7.52±1.08 | 117.67±11.80 |
衰老模型組 | 12 | 5.64±1.46* | 140.24±18.23* |
實施例3組 | 12 | 7.04±1.71△ | 124.65±12.96△ |
註：與青年對照組相比，*P＜0.05；與衰老模型組相比，△P＜0.05。
實驗結果表明，實施例3樣品能夠提高衰老狀態下大鼠血清SOD活性，降低衰老大鼠肝細胞mtDNA的相對含量及MDA含量；同時還能夠增加衰老狀態下大鼠血清IL-2含量，降低IL-6含量，說明三七總皂苷具有提高衰老狀態下內源性抗氧化酶活性，清除體內氧自由基，保護肝細胞mtDNA，提高機體的免疫功能，從多方面延緩機體衰老的作用。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行抗衰老試驗，結果表明，與實施例3的樣品的結果相似，組間差別無統計學意義。
實施例10：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物對大鼠慢性高眼壓視網膜損傷的保護作用
實驗動物：健康Sprague-Dawlay大鼠42隻，雌雄不限，體重200~240克，8~12周齡，經檢查無明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對光反應靈敏。適應性馴養3天后連續測3天眼壓，剔除平均眼壓高於或低於正常眼壓區間（9~16毫米汞柱）者。
動物分組及給藥：6隻為正常對照組，6隻為正常用藥組（實施例4樣品按三七總皂苷計200毫克/千克），其餘30隻按Akira法烙閉大鼠右眼上鞏膜靜脈，製作大鼠持續性高眼壓模型，觀察10天眼壓穩定在30毫米汞柱以上者納入實驗。隨機分為生理鹽水組、量效關係組，分別給予實施例4樣品按三七總皂苷計50毫克/千克（A組）、100毫克/千克（B組）、150毫克/千克（C組）和200毫克/千克（D組），灌胃治療1個月，每日1次。每周測量眼壓1次。各組實驗期滿後取視網膜做全層鋪片，甲酚固紫染色行RGCL神經元計數。
計算機圖像分析：每張待測視網膜鋪片通過視乳頭對稱畫線，將其分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，將每一象限視網膜分為3等份，即中央、中間及周邊3區，各分區隨機取3個點，每點面積為32500平方微米，對每點的視網膜神經元細胞進行計數後換算成每平方毫米的細胞數（細胞數/平方毫米），將每區3點細胞密度的均數作為該區的神經元密度。通過形態學易於辨別RGCL中的血管內皮細胞，具有濃染的核且無尼氏物質的細胞為膠質細胞，這兩種細胞均不納入RGCL神經元計數。
結果：正常SD大鼠右眼及左眼RGCL神經元計數分別為347710±12716/平方毫米及348811±9112/平方毫米，雙眼比較差異無顯著性（P＞0.05）。且從中央區到周邊區神經元計數逐漸減少。正常對照組與正常給藥組比較差異無顯著性（P＞0.05），正常對照組與各濃度治療組實驗眼RGCL計數差異均有顯著性（P＜0.05），各濃度治療組實驗眼與其自身對照眼RGCL計數差異均有顯著性（P＜0.05），生理鹽水組與C組實驗眼RGCL計數差異有顯著性（P＜0.05，見表8）。
表8為各實驗組雙眼RGCL神經元計數（細胞數/平方毫米，）。
組別 | 眼數 | 右眼 | 左眼 |
|---|---|---|---|
正常對照組 | 6 | 347710±12716 | 348811±9113 |
正常給藥組 | 6 | 345615±10915 | 346618±11319 |
生理鹽水組 | 6 | 216617±1011911 | 346319±12112 |
A組 | 6 | 216116±1011111 | 352311±11615 |
B組 | 6 | 221514±911311 | 350515±12113 |
C組 | 6 | 245615±981111 | 350615±12817 |
D組 | 6 | 223610±861311 | 346715±13517 |
註：1）與正常組及自身對照眼比較差異有顯著性意義（P＜0.05）；2）兩者比較差異有顯著性意義（P＜0.05），按神經元直徑（d）將其分為小（d≤8微米）、中（8~14微米）、大（d≥14微米）3組。正常組、生理鹽水組及C組RGCL大神經元兩兩比較差異均有顯著性（P＜0.01），即大神經元對高眼壓視神經損傷更敏感（見表9）。
表9為各組RGCL大、中、小神經元計數（細胞數/平方毫米，）。
組別 | 眼數 | 細胞數/平方毫米 | 小神經元 | 中神經元 | 大神經元 |
|---|---|---|---|---|---|
對照組 | 6 | 347710±12716 | 104617±11413 | 208612±12116 | 34411±431311） |
鹽水組 | 6 | 216617±10119 | 101619±8314 | 108316±9317 | 6612±81011） |
C組 | 6 | 245615±9811 | 100512±9611 | 134514±11914 | 10519±91711） |
註：1）兩兩比較差異均有顯著性（P＜0.01）。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行對大鼠慢性高眼壓視網膜損傷的保護試驗，結果表明，與實施例4的樣品的結果相似，組間差別無統計學意義。
實施例11：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的急性毒性試驗
受試藥物：實施例3樣品，市售血塞通注射液。對照品：25％葡萄糖注射液，20毫升/瓶，
實驗動物：SPF級ICR小鼠，雌雄各100隻，3~4周齡，體重18.0~22.0克。
試驗方法：根據預試驗結果，以500毫克/千克體重的劑量為最高劑量，以0.85的劑間比向下設4個劑量，共5組，試驗過程中可根據動物死亡情況上下設定劑量。小鼠靜脈注射給藥後至少連續觀察4小時，以後每天至少觀察一次，連續14天。主要觀察動物飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應症狀及其起始時間、嚴重程度、持續時間、是否可逆及恢復時間等。給藥前及給藥後第3、7、14天稱體重。解剖觀察：對觀察期死亡的動物和觀察結束後脫頸椎處死的動物進行解剖，觀察各組織和器官的體積、顏色、質地等有無異常。組織病理學檢查：如解剖觀察到組織、器官出現異常時，及時取材進行組織病理學檢查。
結果：採用小鼠一次靜脈注射LD50測定試驗，觀察、比較實施例3與市售血塞通注射液的急性毒性反應。結果顯示：實施例3樣品小鼠單次靜脈注射的LD50為383毫克/千克，最大耐受量為256毫克/千克，市售血塞通注射液小鼠單次靜脈注射的LD50為293毫克/千克，最大耐受量為187毫克/千克。說明實施例3樣品小鼠的最大耐受量與半數致死劑量均高於市售血塞通注射液。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行急性毒性試驗，結果表明，與實施例3的樣品的急毒結果相似的，組間差別無統計學意義。
實施例12：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的異常毒性試驗
參照《中國藥典》2005版一部附錄X VIII B異常毒性檢查法，對實施例4樣品和市售注射用血塞通凍乾粉針進行異常毒性檢查，小鼠尾靜脈緩慢注射供試液0.5毫升（2.5毫克）/只，給藥小鼠飲食活動正常，飼養觀察48小時無死亡，兩種樣品的最大給藥劑量分別為：實施例4樣品：25毫克/毫升，市售注射用血塞通凍乾粉針：12毫克/毫升，表明《一種藥物組合物及其製備方法》製成的凍乾粉針劑比市售的注射用血塞通凍乾粉針異常毒性試驗發生死亡的最小劑量要大一倍多。
上述兩項試驗結果表明，《一種藥物組合物及其製備方法》產品在毒性和異常毒性兩方面，與市售的三七總皂苷注射劑相比，毒性反應劑量明顯提高，說明《一種藥物組合物及其製備方法》產品在安全性方面有顯著改善。
參照上述實驗方案，對實施例1-6其他的藥物組合物進行異常毒性試驗，結果表明，與實施例4的樣品的結果相似，組間差別無統計學意義。
實施例13：《一種藥物組合物及其製備方法》所述藥物組合物的溶血性試驗
依據《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究技術指導原則》的試驗方法進行溶血試驗，觀察《一種藥物組合物及其製備方法》產品及相關三七總皂苷注射劑樣品在不同濃度下的溶血與凝聚情況。
藥物：《一種藥物組合物及其製備方法》實施例3、實施例4樣品，市售血塞通注射液、注射用血塞通。2％紅細胞混懸液的製備：取兔血20-30毫升，除去纖維蛋白原，加氯化鈉注射液約10倍量洗滌，1500轉/分鐘離心15分鐘，棄上清液，重複2-3次，直至上清液不顯紅色為止，棄上清液，將所得紅細胞用氯化鈉注射液配製成2％紅細胞混懸液，供試驗用。
供試液的製備：精密取實施例3、實施例4樣品，分別加氯化鈉注射液稀釋/溶解為每1毫升含15毫克和25毫克的溶液作為供試液。
檢驗方法：分別取試管7支，其中1~5號管為受試藥物管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按下表所示加入2％紅細胞混懸液、氯化鈉注射液、蒸餾水，混勻後立即置於37攝氏度±0.5攝氏度的恆溫水箱中進行溫育。開始每隔15分鐘觀察一次，1小時後間隔1小時觀察一次，連續24小時。
試管編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
2％紅細胞混懸液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
氯化鈉注射液 | 2.0 | 2.1 | 2.2 | 2.3 | 2.4 | 2.5 | 0 |
蒸餾水 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2.5 |
受試藥物 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | 0 | 0 |
如試驗中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發生；如紅細胞全部下沉，上清液無色澄明，表明無溶血發生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉澱，振搖後不分散，表明有紅細胞凝聚發生。
如有紅細胞凝聚的現象，可按下法進一步判定是凝聚還是假凝聚。若凝聚物在試管振盪後又能均勻分散，或將凝聚物置於載玻片上，在載玻片邊緣滴加2滴氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚紅細胞能被衝散者為假凝聚，若凝聚物不被搖散或在玻片上不被衝散者為凝聚。
結果判斷：當陰性對照管無溶血和凝聚發生，陽性對照管有溶血發生時，15毫克/毫升若供試品第3管（0.3毫升）中的溶液在3小時內不發生溶血和凝聚，判供試品符合規定；若供試品管第3管（0.3毫升）中的溶液在3小時內發生溶血和凝聚，判供試品不符合規定。
試驗結果：《一種藥物組合物及其製備方法》實施例3、實施例4樣品在濃度高達25毫克/毫升濃度下第3管（0.3毫升）中的溶液在3小時內沒有發生溶血和凝聚，第1管（0.5毫升）3小時開始發生溶血反應，第2管（0.4毫升）5小時開始發生溶血反應；15毫克/毫升，濃度下未發生溶血反應。血塞通注射液及注射用血塞通在濃度為15毫克/毫升濃度時第2管（0.4毫升）中的溶液在3小時已發生溶血反應，其它3、4、5管未發生溶血現象。
溶血是很多皂苷類成份的特性，而對於三七總皂苷其中人參皂苷Rg1有溶血作用，而人參皂苷Rb1則有抗溶血作用，因此，當二者比例適當時，既可保證藥效的發揮，又能避免溶血不良反應的發生。《一種藥物組合物及其製備方法》在三七總皂苷的製備充分考慮了二者的比例關係，因此，其溶血濃度遠大於市售血塞通注射液，從而更能提高產品的安全性。
參照上述實驗方案，對實施例1-5其他的藥物組合物進行溶血試驗，結果表明，與實施例3、4的樣品的結果相似，組間差別無統計學意義。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種藥物組合物及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
