TGFβ信號通路對基質蛋白表達的調控作用研究

《TGFβ信號通路對基質蛋白表達的調控作用研究》是依託清華大學，由謝莉萍擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：TGFβ信號通路對基質蛋白表達的調控作用研究
• 依託單位：清華大學
• 項目負責人：謝莉萍
• 項目類別：面上項目

項目摘要

基質蛋白在珍珠和貝殼的形成過程中具有重要的作用，研究TGFβ信號通路對其表達的調控作用，將有助於從細胞和分子水平揭示珍珠形成的機理及信號轉導途徑。本課題擬從合浦珠母貝體內克隆TGFβ信號通路中幾種關鍵蛋白的同源編碼基因，包括受體蛋白Smad5、輔助因子Smad4、拮抗因子Smad6以及軟骨形成相關蛋白Sox9、Sox5，進而研究TGFβ信號對珍珠和貝基質蛋白表達的調控作用。刺激或抑制Smad3和Smad5，檢測不同生長狀態下各轉錄因子和基質蛋白mRNA表達的變化情況，從而鑑定可能受到TGFβ信號調控的基質蛋白。重點以基質蛋白KRMP為對象，利用CHIP和EMSA等實驗研究Sox9蛋白與其啟動子的結合位點；利用螢光素酶報告基因載體（pGL3）研究Smad3、Smad5及Sox9對KRMP啟動子轉錄活性的調節作用，以期探明TGFβ信號通路調控KRMP蛋白表達的機制和信號傳導途徑。

結題摘要

在合浦珠母貝貝殼和珍珠形成過程中，基質蛋白發揮了十分重要的作用，本項目旨在研究生物礦化過程中基質蛋白的表達調控機制，尤其是TGFβ信號通路對富含賴氨酸的基質蛋白（KRMP）表達的調控作用，以揭示珍珠形成過程中的分子機理及信號轉導途徑。本項目的研究成果將為特殊仿生材料的研製提供理論依據。取得的主要成果如下： （1）克隆得到了TGFβ信號通路中4種轉錄因子Pf-Smad3/4/5/6，以及轉錄因子Pf-Sox9的cDNA序列及其編碼的胺基酸序列，並通過結構分析進行了確認。組織表達分析研究表明，TGFβ信號通路成員在鰓和外套膜中表達量較高，並定位於外套膜中褶、外褶、緣膜區上皮細胞等礦化相關部位，推測其與生物礦化過程的相關性。幼貝發育不同時期基因表達的分析結果表明，Smad蛋白在幼貝發育和貝殼形成的不同時期皆發揮了重要作用。 （2）克隆鑑定了TGFβ/BMP信號通路的受體基因，PfBMPR1B和PfBAMBI，並套用酵母雙雜交技術證實了信號通路各成員之間存在互作關係。初步闡述了生物礦化過程中TGFβ信號通路的級聯反應模式。 （3） 研究了TGFβ信號通路對幾種基質蛋白基因表達的影響，套用Real-Time PCR，western檢測得知，用BMP2激活TGFβ信號通路時，可提高KRMP的表達，推測其通過增強Smad1/5的蛋白磷酸化水平而實現的。BMP2的競爭性抑制劑Noggin可抑制KRMP家族蛋白基因的表達。當受體BMPR1B的基因被抑制後，KRMP蛋白的表達水平也降低。通過RNAi實驗抑制Pf-Smad3/5/6基因，發現不同的基質蛋白表達呈現不同的變化規律，貝殼的表型也有變化，表明TGFβ信號通路對基質蛋白的調控網路是十分複雜的。 （4） 克隆得到了KRMP3/4/8的核心啟動子序列，證實了轉錄因子Sox9對KRMP啟動子具有轉錄抑制作用，並初步確定了Sox9與KRMP3啟動子的結合區域。證實了TGFβ信號通路參與了對基質蛋白基因的轉錄調控過程。 （5） TGFβ信號通路在貝殼損傷修復過程中的作用研究表明，當抑制Smad3/6基因的表達，不同基質蛋白呈現不同的變化規律，說明在貝殼修復過程中TGFβ信號通路與其他調控機制共同作用於新貝殼的形成。