《TGF-β1 相關差異性miRNAs在橫紋肌肉瘤分化抑制中的調控機制》是依託蘇州大學，由王守立擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：TGF-β1 相關差異性miRNAs在橫紋肌肉瘤分化抑制中的調控機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王守立
- 依託單位：蘇州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
橫紋肌肉瘤（RMS）低分化類型多見，但其分化阻滯的分子機制仍不詳。在本課題組前期發現TGF-β1信號轉導通過抑制肌轉錄因子MyoD下調肌分化相關基因表達的基礎上，結合國外關於成肌細胞體外分化過程中MyoD促進肌特異性miRNA表達的研究結果，我們推測RMS中肌特異性miRNA的低表達與TGF-β1介導的MyoD功能抑制密切相關。預實驗結果也顯示抑制TGF-β1表達能明顯促進RMS細胞中MyoD與肌特異性miR-206的結合。本研究在已建立的TGF-β1siRNA表達載體穩轉細胞株基礎上，採用miRNAs基因晶片、生物信息學、RIP及螢光素酶報告系統等技術，擬闡明TGF-β1相關差異性miRNAs在RMS分化阻滯中的作用，擬證實MyoD在TGF-β1信號轉導與miRNAs調控靶基因中的橋樑作用，明確RMS分化阻滯的分子調控網路，為進一步開發針對調控網路中關鍵分子的靶點藥物奠定理論基礎。
結題摘要
本研究探討TGF-β1信號通路與相關差異性microRNAs在人橫紋肌肉瘤(RMS)肌分化調控中的作用。方法：(1) 用TGF-β1-siRNA處理RMS細胞株RD, SMS-CTR和RH28細胞，利用miRNA晶片聚類分析RMS細胞株中TGF-β1相關miRNAs的表達圖譜。並用免疫組織化學（IHC）、RT-PCR、Western blot和Northern blot在RMS組織中驗證。(2) 將篩選出的miRNA (miR-450b-5p)-成熟體(mimics, M)或抑制子(inhibitors, I)轉染RD細胞和RH28細胞，採用RT-PCR法檢測miR-450b-5p的表達。採用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法和MTT法檢測轉染後細胞的增殖情況。採用疫螢光染色法檢測轉染後RD細胞的Caspase-3和TUNEL，觀察細胞凋亡情況。(3) 將RD細胞接種到裸鼠用於體內實驗，瘤內注射M或I後，採用體積測量初步估計M或I對致瘤性的影響。採用IHC對M處理的皮下RD組織染色檢測其Ki67、肌形成蛋白、肌球蛋白和結蛋白表達。(4) 通過Target Scan6.1, Diana microT 4.0和MICRORNA.ORG生物信息軟體篩選出miR-450b-5p的靶點。用靶點的野生型 /突變型-報告基因(Wt.UTR /Mut.UTR)和M /I共轉染RD細胞，採用螢光素酶檢測miR-450b-5p的功能性靶點. (5)用TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA, Smad2-siRNA和Smad3-siRNA轉染RD細胞，同時結合外源性TGF-β1處理，採用RT-PCR檢測miR-450b-5p表達水平。首次發現：(1) miRNA晶片結果顯示，TGF-β1-siRNA處理的RMS細胞株中miR-4275, miRNA-4298, miR-411, miR-493* and miR-450b-5p表達增高，只有miR-2113的表達顯著下調；IHC和RT-PCR檢測發現TGF-β1低表達的RMS組織中miR-450b-5p的高過表達最為顯著，並通過Western blot、Northern blot和RT-PCR得到驗證。(2) RT-PCR結果顯示，合成的miR-450b-5p類似物(Mimics, M)顯著增加了miR-450b-5p的
