《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》是亳州市新健康科技有限公司於2015年5月13日申請的發明專利，該專利申請號為2015102444618，公布號為CN104845970A，專利公布日為2015年8月19日，發明人是熊良鐘。
《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》涉及與乳頭狀甲狀腺癌有關的基因及其套用，根據該基因的鹼基序列，設計併合成實時定量PCR引物，在乳頭狀甲狀腺癌臨床病例標本中檢測該基因所轉錄的長鏈非編碼RNA的表達水平，發現所述長鏈非編碼RNA在乳頭狀甲狀腺腫瘤組織中的表達顯著下調，基因沉默所述長鏈非編碼RNA可以顯著促進甲狀腺癌細胞生長。該發明有望製備用於乳頭狀甲狀腺癌輔助診斷、基因治療、療效預測或預後判斷的製劑。
2019年5月16日，《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》獲得安徽省第六屆專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因
- 公布號：CN104845970A
- 公布日：2015年8月19日
- 申請號：2015102444618
- 申請日：2015年5月13日
- 申請人：亳州市新健康科技有限公司
- 地址：安徽省亳州市現代中藥產業創業基地B區10#B座
- 發明人：熊良鐘
- 代理機構：北京律恆立業智慧財產權代理事務所
- 代理人：龐立岩、蔡倫
- Int.Cl.：C12N15/113(2010.01)I；C12Q1/68(2006.01)I；C12N15/11(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，其發病率增長迅速，已成為最常見的惡性腫瘤之一，也是2015年5月之前發病率增長最快的一種實體腫瘤。其中，90％是乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）。雖然乳頭狀甲狀腺癌的死亡率和其他惡性腫瘤相比死亡率比較低，但是乳頭狀甲狀腺癌轉移率很高，淋巴結轉移率高達30％-50％，如果乳頭狀甲狀腺癌轉移和復發，病人沒能及時診斷，結果喪失最佳手術時機，死亡率則顯著升高，是預後不良的重要指標。
流行病學證據表明，在中國很多地區，女性中乳頭狀甲狀腺癌的發病率已超過乳腺癌，位居第一位。乳頭狀甲狀腺癌的發生是一個多基因、多步驟的病變過程，包括遺傳學等一系列改變。病因學研究揭示，該惡性腫瘤為遺傳因素貢獻最大的一種惡性腫瘤。越來越多的證據表明，體細胞的基因突變造成的癌基因激活與抑癌基因失活在腫瘤的發生髮展過程中扮演著至關重要的作用，因此，對於乳頭狀甲狀腺癌體細胞突變篩查有助於發掘其發病的驅動基因。
截至2015年5月，對甲狀腺癌的診斷主要依靠甲狀腺超聲以及穿刺活檢病理，雖然穿刺活檢病理診斷甲狀腺癌已經廣泛套用於臨床，但仍存在30％可疑或不確定是否為甲狀腺癌的診斷結果，並且穿刺是一項有創檢查，給患者帶來較大痛苦。甲狀腺癌一般以手術治療，早期發現進行治療的患者五年生存率能達95％，晚期發現的患者五年生存率降至59％，因此為提高甲狀腺癌診斷的準確性和早期診斷率，有必要尋找一種創傷性小，靈敏度和特異度均較高的新的診斷方法。
由於腫瘤遺傳的複雜性，傳統的體細胞突變篩查方法無法對腫瘤有一個整體的認識。而作為一種高效和高靈敏度的技術，全基因外顯子組測序能發現外顯子區的絕大部分的疾病相關變異，可檢測常見變異和頻率<5％的低頻突變，通過對外顯子區域的基因突變進行測定，一方面有助於確定乳頭狀甲狀腺癌相關癌基因及抑癌基因，為其早期分子診斷提供依據；另一方面有助於更好地定性腫瘤，揭示相似組織病理類型和不同臨床特徵的亞臨床分類，幫助確定不同亞型乳頭狀甲狀腺癌的治療敏感性和判斷預後；更為關鍵的是，外顯子組測序技術有助於尋找乳頭狀甲狀腺癌基因突變相關的最佳藥物靶點，從而改變相應分子調控網路和相關代謝途徑，使乳頭狀甲狀腺癌個體化治療成為可能。
該發明中所引述的文獻、著作、專利和專利申請公開書，其中全部或局部都明確地和獨立地都在該專利申請書引用參考。
發明內容
專利目的
《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》的目的在於提供一種基因，該基因命名為GAS8-AS1，其序列如序列表SEQIDNO：1所示。
該發明的另一目的在於提供的GAS8-AS1基因在製備篩選、檢測或輔助診斷乳頭狀甲狀腺癌的試劑的用途。
該發明的另一目的在於提供與GAS8-AS1基因在嚴格條件下雜交的核酸分子，用於製備檢測GAS8-AS1基因的試劑。
技術方案
在《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》的一個優選實施方案中，所述核酸分子的序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。
在該發明的一個優選實施方案中，所述試劑盒為實時定量PCR檢測試劑盒。
在該發明的另一個優選實施方案中，所述試劑盒中包括的核酸分子的序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。
改善效果
隨著後期研究結果的深入，GAS8-AS1在PTC中的功能及其作用機制將逐步闡明，這一新穎的長鏈非編碼RNA不僅能成為診斷相關的生物標誌物，更有望成為新的PTC治療靶點以改善、提高臨床PTC治療效果，具有十分重要的現實意義。
附圖說明
圖1為lncRNA GAS8-AS1基因及相關基因突變示意圖；
圖2為RNAfold軟體預測lncRNA GAS8-AS1的RNA二級結構圖；
圖3為浙江佇列和淮安佇列中檢測乳頭狀甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中，lncRNA GAS8-AS1的表達水平示意圖；
圖4為轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒後，乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情況示意圖；
圖5為實時定量PCR檢測轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒後乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平情況示意圖；
圖6為轉染針對lncRNA GAS8-AS1的siRNAs後，乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66和TPC-1的增殖情況示意圖；
圖7為實時定量PCR檢測轉染針對lncRNA GAS8-AS1的siRNAs後乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平情況示意圖。
技術領域
《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》涉及分子生物學技術領域，具體地說，涉及與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因及其PCR檢測方法。
權利要求
如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核酸分子用於製備篩選、檢測或輔助診斷乳頭狀甲狀腺癌的試劑的用途。
實施方式
《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》的目的在於提供一種基因，該基因命名為GAS8-AS1，其序列如序列表SEQIDNO：1所示。
GAS8-AS1基因（NCBI-GeneID:750），又名C16orf3基因（16號染色體開放閱讀框3），位於人類16號染色體GAS8基因2號內含子中。GAS8-AS1基因不含任何內含子序列，與GAS8基因相反的方向轉錄產生一條長鏈非編碼RNA（lncRNA），該RNA不能翻譯成蛋白質。目前，對於該基因及其轉錄產物的生物學功能仍不清楚。
GAS8-AS1的基因序列（NCBIReferenceSequence:NR_122031.1）如下： 1acctgcagtcccagctactgggcagcctgaagcagcaggatggtgtgaacccaggaggtg 61gagcttgcagtgagccgaggtcgcgccaccgcactccagcctgggccacacagcgagatt121ccgtcagaatcagttacttttcgggcacagccccaggccacttactgtgagcctttttct181ttctcaacaccacattccccacagggaaaacacatttctcacctcaaaagaagacaagac241aacgagcaaacaagaaggagcagcaggaggggttctgagccgaggatgccgggcagacat301gagggagacacgcacccccgaatccaaccagtgcctcggcacaacgacaaatgtcttcac361gtcacagacctttagaggctcctgggcagagcctgaaccagggctcctgactggtctgtt421tggctcacatggtgttgagattttgccatcactcaatattcagatttcttataaatatcc481agatttccagcttctcttggaaaatcagaaaaaaacagcactgaactcctaggcccacaa541ggcactccccagtgaacagatgaaactgtcctctgctgcggggcaggagtctccaggtca601cccccatccctccccacctgcctggaccctgaagaagccttctgagtctgtggctcaacg661tgcgatgtgcagtgcaagggcctgccccgtagcctgccccgtaggctgccccatagcctg721ccccgtaagctgccccgtagcctgccccgtaggctgccccgtaggctccatggccactgc781cccacaaggcctgtctccacaggaatgggaagcggacagggagacgggcagcagctcaca841tgctgggacaacgcagtgttcaatccattctccatccagcagctccagacatctttccag901aacacaaacctgaccccatcacctctctgcttagccactggcttaaactgccaatggttt961gcctgcatgtaaaataaagccattctttaccattaaaaaa（SEQIDNo.1）
長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年研究發現它是一類具有重要生物學功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，在細胞分化和發育、基因轉錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發揮重要的調控作用。
該發明的另一目的在於所提供的GAS8-AS1基因在製備篩選、檢測或輔助診斷乳頭狀甲狀腺癌的試劑的用途。
該發明的另一目的在於提供與GAS8-AS1基因在嚴格條件下雜交的核酸分子，用於製備檢測GAS8-AS1基因的試劑。所述核酸分子的序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。 該發明的另一目的在於提供一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括與GAS8-AS1基因在嚴格條件下雜交的核酸分子，可用於檢測GAS8-AS1基因。顯然，本領域技術人員在獲知該發明公開的如SEQIDNO：1所示的基因序列和如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的引物序列之後，在該發明基礎上不需付出創造性勞動就可以製備其他用於檢測GAS8-AS1基因的引物和試劑盒，所述試劑盒的檢測方法包括但不限於實時定量PCR方法。所述試劑盒中可以包括如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核酸分子或其他可以與GAS8-AS1基因在嚴格條件下雜交的分子。任選的，所述試劑盒中還可以包括實施常規基因檢測所需的輔助試劑。
- 實施例1：突變測序方法
1.1採集受檢者腫瘤組織樣本
1.2基因組DNA抽提
準備高壓滅菌後的研缽，晾乾後倒入液氮預冷；取適量組織於研缽中研碎，期間補充液氮，研磨成粉末狀後解凍；用800微升PBS溶液收集研缽中的組織放入離心管中（1.5毫升）；12000轉/分鐘離心1分鐘，取出棄上清。然後加200微升緩衝液GA，振盪至徹底懸浮。
加入20微升蛋白酶K（20毫克/毫升），充分混勻後，於56℃保溫2小時，每20分鐘搖1次，至組織溶解。
加入200微升GB緩衝液顛倒混勻，於70℃保溫10分鐘，至溶液變清亮。
加入200微升無水乙醇，充分振盪15秒，此時應出現絮狀沉澱。
將上述溶液及絮狀沉定轉移至CB3吸附柱中，然後12000轉/分鐘離心30秒，棄收集管中液體。
向CB3吸附柱中加入500微升GD，12000轉/分鐘離心30秒，棄收集管中液體。
向CB3吸附柱中加入600微升PW（使用前檢查是否已加入乙醇），12000轉/分鐘離心30秒，棄收集管中液體。重複此步驟2次。
12000轉/分鐘，離心2分鐘，棄廢液，然後放置數分鐘，晾乾殘留的漂洗液。
更換收集管，向CB3吸附柱內加入50微升-200微升TE溶解DNA，室溫放置5分鐘，12000轉/分鐘離心2分鐘，收集得到DNA-20℃保存備用。
1.3模板製備
採用的是固相PCR（Illu分鐘a的Hiseq）法，即把這個擴增過程放在了玻璃載片上。高密度的正向和反向引物共價連線在這些玻璃載片上，模板和引物的比例決定了擴納簇的密度。固相PCR能夠生成一到兩億空間上隔離的模板簇，並提供自由末端給通用的測序引物，用以起始測序反應。
1.4外顯子組捕獲
利用Agilent公司的50兆 Sure Select XT Human All Exon V5kit針對人外顯子液相靶向序列富集系統進行高覆蓋率的外顯子區域捕獲。All Exon 50兆試劑盒是Agilent與Wellcome Trust SangerInstitute、Gencodeconsortium合作開發的人全外顯子捕獲試劑盒。外顯子的捕獲量可達50兆。捕獲對象：①、GENCODEproject中發現的外顯子（約12M）；
②、NCBI Consensus CD Sdatabase（CCDS， March2009）中的外顯子；③、Sanger V13 data base中的miRNA；④、多於300條的humannon-coding RNAs（例如snoRNAs和scaRNAs）。
1.5靶向測序及生物信息學分析
Illu分鐘a的Hiseq2000測序的基本原理是邊合成邊測序，又稱循環可逆終止。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有鹼基特異螢光標記的四種dNTP。由於這些dNTP的3’羥基被化學方法保護，因而每輪合成反應都只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上後，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫。加入激發螢光所需的緩衝液，用雷射激發螢光信號，用光學設備完成螢光信號的記錄，再通過計算機分析轉化為測序結果。當螢光信號的記錄完成後，加入化學試劑淬滅螢光信號並去除dNTP的3’羥基保護基團，恢復3’端粘性，繼續聚合第二個核苷酸。如此繼續下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統計每輪收集到的螢光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。這種測序方法的優勢是減少了樣品分離和製備的時間，配對末端讀長可達到2×50bp，每次運行後可獲得超過20GB的高質量過濾數據，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。 針對乳頭狀甲狀腺癌進行靶向測序，通過構建高斯混合模型的方法，將得到的短
片段序列與參考序列比對（mapping），尋找突變（variantcalling），以及對突變的過濾篩選。
- 實施例2：GAS8-AS1等基因可作為乳頭狀甲狀腺癌的篩選或檢測的靶標
2.1實驗方法
該發明利用如實施例1所述的全基因組外顯子技術對91對乳頭狀甲狀腺癌患者的配對組織（甲狀腺癌組織和外周血樣本）進行靶向測序，獲取基因突變情況。最終確定了GAS8-AS1等基因為中國漢族人群乳頭狀甲狀腺癌易感基因。乳頭狀甲狀腺癌患者的配對組織指的是患者的甲狀腺癌組織和外周血樣本，所述91對甲狀腺癌患者的組織樣本委託中國醫學科學院腫瘤醫院和浙江省腫瘤醫院採集。
2.2實驗結果
2.21基因突變頻次統計
對91對乳頭狀甲狀腺癌配對組織進行二代測序，高頻突變基因見表1。
2.22乳頭狀甲狀腺癌易感基因
針對高頻突變基因經MutsigCV軟體分析，最終確定GAS8-AS1為中國漢族人群乳頭狀甲狀腺癌易感基因。見表1。
基因 | 非沉默突變數 | 沉默突變數 | 非編碼區突變數 | P值 | 錯誤發現率 |
|---|---|---|---|---|---|
BRAF | 53 | 1 | 0 | ＜1.0E-16 | ＜1.0E-16 |
GAS8-ASI | 15 | 0 | 0 | ＜1.0E-16 | ＜1.0E-16 |
注釋:
1：該基因中的非沉默突變數；
2：該基因中的沉默突變數；
3：該基因中的非編碼區突變數；
4：經MutSigCV軟體計算所得；
5：多重檢驗校正結果。
- 實施例3：GAS8-AS1基因檢測可作為乳頭狀甲狀腺癌的篩選或檢測的靶標
GAS8-AS1基因（NCBI-GeneID：750），又名C16orf3基因（16號染色體開放閱讀框3），位於人類16號染色體GAS8基因2號內含子中。GAS8-AS1基因不含任何內含子序列，與GAS8基因相反的方向轉錄產生一條長鏈非編碼RNA（lncRNA），該RNA不能翻譯成蛋白質。截至截至2015年5月，對於該基因及其轉錄產物的生物學功能仍不清楚。
GAS8-AS1的基因序列（NCBIReferenceSequence:NR_122031.1）如下： 1acctgcagtcccagctactgggcagcctgaagcagcaggatggtgtgaacccaggaggtg 61gagcttgcagtgagccgaggtcgcgccaccgcactccagcctgggccacacagcgagatt121ccgtcagaatcagttacttttcgggcacagccccaggccacttactgtgagcctttttct181ttctcaacaccacattccccacagggaaaacacatttctcacctcaaaagaagacaagac241aacgagcaaacaagaaggagcagcaggaggggttctgagccgaggatgccgggcagacat301gagggagacacgcacccccgaatccaaccagtgcctcggcacaacgacaaatgtcttcac361gtcacagacctttagaggctcctgggcagagcctgaaccagggctcctgactggtctgtt421tggctcacatggtgttgagattttgccatcactcaatattcagatttcttataaatatcc481agatttccagcttctcttggaaaatcagaaaaaaacagcactgaactcctaggcccacaa541ggcactccccagtgaacagatgaaactgtcctctgctgcggggcaggagtctccaggtca601cccccatccctccccacctgcctggaccctgaagaagccttctgagtctgtggctcaacg661tgcgatgtgcagtgcaagggcctgccccgtagcctgccccgtaggctgccccatagcctg721ccccgtaagctgccccgtagcctgccccgtaggctgccccgtaggctccatggccactgc781cccacaaggcctgtctccacaggaatgggaagcggacagggagacgggcagcagctcaca841tgctgggacaacgcagtgttcaatccattctccatccagcagctccagacatctttccag901aacacaaacctgaccccatcacctctctgcttagccactggcttaaactgccaatggttt961gcctgcatgtaaaataaagccattctttaccattaaaaaa（SEQIDNo.1）
長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年研究發現它是一類具有重要生物學功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，在細胞分化和發育、基因轉錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發揮重要的調控作用。近年來，越來越多的權威研究證實lncRNA在腫瘤的發生髮展中起著抑制或促進腫瘤的作用，在調控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲轉移能力等方面，均具有十分重要作用。
3.1實驗方法
3.1.1該發明利用如實施例1所述的全基因組外顯子技術對91對乳頭狀甲狀腺癌配對組織進行靶向測序。
3.1.2利用實時定量PCR的方法，對委託浙江省腫瘤醫院和淮安市第二人民醫院採集的87對乳頭狀甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的RNA樣本進行基因表達情況的檢測（在該發明中分別稱為浙江佇列和淮安佇列）。實時定量PCR檢測試劑盒包括根據GAS8-AS1基因的序列設計的實時定量PCR所用引物：GAS8-AS1-F和GAS8-AS1-R，其序列SEQIDNo.2和SEQIDNo.3如下表所示：
引物 | 序列（5' to 3'） |
|---|---|
GAS8-AS1-F | GAAGGAGGAAACAAGAAGGAG（SEQ ID No.2） |
GAS8-AS1-R | TGAGCCAAACAGACCAGTCA（SEQ ID No.3） |
3.1.3利用體外培養乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66、NPA和TPC-1，分別向上述細胞中轉染攜帶lnc RNA GAS8-AS1基因的質粒或針對lnc RNA GAS8-AS1的si RNAs，轉染後24小時及48小時進行細胞計數，觀察lnc RNA GAS8-AS1基因對乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖的影響。 3.2實驗結果
3.2.1如表1所示，全基因組外顯子技術對91對乳頭狀甲狀腺癌配對組織進行靶向測序，確定8例患者攜帶GAS8-AS1基因突變，突變率為8.8％，因此確定GAS8-AS1基因為中國漢族人群乳頭狀甲狀腺癌易感基因。圖1為lncRNA GAS8-AS1基因及相關基因突變示意圖。RNAfold軟體預測lnc RNA GAS8-AS1的RNA二級結構如圖2所示。
3.2.2圖3為對來自浙江佇列和淮安佇列的乳頭狀甲狀腺患者檢測其乳頭狀甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中，lncRNA GAS8-AS1的表達水平示意圖。如圖所示，利用實時定量PCR法檢測浙江佇列和淮安佇列中的87對乳頭狀甲狀腺癌組織及正常組織中的GAS8-AS1基因表達後，發現其表達在腫瘤組織中顯著下調，提示其為甲狀腺癌的全新抑癌基因。 3.2.3圖4為轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒後，乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情況示意圖。如圖4所示，轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒後，GLAG66、NPA和TPC-1的增殖情況明顯低於未轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒的載體。因此，lncRNA GAS8-AS1可以顯著抑制GLAG66、NPA和TPC-1的增殖。
圖5為利用實時定量PCR法檢測轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒後乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平情況，由圖可知，未轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒的載體，GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平很低，基本在1.0左右；轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒的載體，GLAG66、NPA和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平分別在49、41、55左右，顯著高於未轉染攜帶lncRNA GAS8-AS1基因質粒的載體。
轉染針對lncRNA GAS8-AS1的GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2後，會顯著增加乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66和TPC-1的增殖，如圖6所示，表明基因沉默lncRNA GAS8-AS1可以顯著增加上述細胞的增殖。利用實時定量PCR檢測得知轉染針對lncRNA GAS8-AS1的GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2後乳頭狀甲狀腺癌細胞系GLAG66和TPC-1中lncRNA GAS8-AS1的表達水平均低於0.6，而未轉染GAS8-AS1-siR-1和GAS8-AS1-siR-2的表達水平為1.0，如圖7所示。
綜上，在體外培養乳頭狀甲狀腺癌細胞中，過表達GAS8-AS1基因可以顯著抑制甲狀腺癌細胞生長。反之，基因沉默GAS8-AS1基因可以顯著促進甲狀腺癌細胞生長。
榮譽表彰
2019年5月16日，《與乳頭狀甲狀腺瘤相關的基因》獲得安徽省第六屆專利獎優秀獎。
