《miR-20a-5p在成骨細胞和脂肪細胞分化中的調控功能及機制研究》是依託天津醫科大學，由朱恩東擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：miR-20a-5p在成骨細胞和脂肪細胞分化中的調控功能及機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：朱恩東
- 依託單位：天津醫科大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
miRNAs對成骨和脂肪細胞的分化調控已成為研究熱點。本項目組前期研究發現骨髓間充質幹細胞誘導成骨後miR-20a-5p表達下降，誘導成脂後表達升高。體外實驗證實miR-20a-5p可能通過靶向調控Kdm6b以及Tgfbr2而促進前脂肪細胞系分化。本項目在此基礎上，擬採用原代骨髓間充質幹細胞完善miR-20a-5p影響成骨/成脂分化的研究；在其發揮調控功能的下游，篩選鑑定其新的靶基因，通過功能獲得性和功能缺失性研究確證靶基因的功能，並通過拯救實驗確定miR-20a-5p是否通過新的靶基因發揮調控作用；分析miR-20a-5p啟動子區的順式作用元件，揭示其在分化過程中表達變化的上游調控機制，深入闡明上游影響其發揮調控功能的分子機制；進一步探討miR-20a-5p對小鼠活體骨再建、骨量及成骨/成脂分化的影響。本研究有助於進一步揭示miRNAs在骨組織細胞發育和骨再建等過程中的調控作用。
結題摘要
本項目組前期研究發現骨髓間充質幹細胞誘導成骨後miR-20a-5p表達下降，誘導成脂後表達升高。體外實驗證實miR-20a-5p可能通過靶向調控Kdm6b以及Tgfbr2而促進前脂肪細胞系分化。本項目成功分離培養小鼠原代骨髓間充質幹細胞（BMSCs），構建了miR-20a-5p的慢病毒過表達重組質粒及敲減（sponge）重組質粒並包裝相應慢病毒用於原代細胞的感染。我們發現miR-20a-5p在成脂分化前3天表達量逐漸升高，隨後2天仍保持較高的表達水平。miR-20a-5p過表達慢病毒及mimics均可以提高小鼠BMSCs中miR-20a-5p的水平，促進BMSCs的成脂分化，且上調成脂標誌性基因PPARγ、C/EBPα和a P2蛋白水平。相反，miR-20a-5p sponge慢病毒及inhibitor均可以降低小鼠BMSCs中內源mi R-20a-5p的水平，抑制BMSCs的成脂分化，同時下調成脂分化過程中關鍵基因的蛋白水平。根據靶基因預測軟體Target Scan預測結果結合雙螢光素酶和GFP報告基因分析實驗證實Klf3是miR-20a-5p的直接靶基因。Klf3的沉默表達可以促進小鼠BMSCs向脂肪細胞分化，與miR-20a-5p過表達的作用相同；拯救實驗結果提示miR-20a-5p可通過抑制Klf3發揮促進成脂分化的作用。我們還發現與單獨的 Klf3 相比，Klf3、Kdm6 和 Tgfbr2 三者能更有效的減弱miR-20a-5p的促成脂作用。此外，miR-20a-5p可以促進BMSCs的成骨分化，表現為鹼性磷酸酶染色增強。我們還鑑定Nfic基因為miR-20a-5p的直接靶基因。我們發現Nfic基因在小鼠的骨組織中特異性高表達，ALP染色和RT-qPCR檢測可見，在BMSC中過表達Nfic可以顯著促進細胞成骨分化，而抑制Nfic的表達則顯著抑制骨髓基質細胞系ST2成骨分化；Nfic可能通過LRP5影響Wnt信號通路進而調控了成骨細胞的分化。通過生物信息學預測及雙螢光素酶報告系統檢測和染色體免疫共沉澱檢測實驗，我們證明Nfic可以與miR-20b-5p promotor結合併抑制其表達。本研究進一步揭示了miR-20b-5p在成骨/成脂細胞分化進程中的分子機制，有助於闡釋miRNAs在骨組織細胞發育和骨再建等過程中的調控作用。
