一株植物乳桿菌及其套用

《一株植物乳桿菌及其套用》是廣州格拉姆生物科技有限公司於2015年9月2日申請的專利，該專利的公布號為CN105132322A，申請號為2015105598995，授權公布日為2015年12月9日，發明人是張宏剛、李莉。

《一株植物乳桿菌及其套用》公開了一株植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GLM101及其在製備飼料添加劑中的套用。該菌株已於2015年7月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11156。該發明植物乳桿菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、創傷弧菌和嗜水氣單胞菌具有很強的抑制能力，並具有良好的耐酸、膽鹽的能力。可用於調節動物腸內微生態平衡，具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、促進動物生長和提高飼料轉化率。

2018年12月20日，《一株植物乳桿菌及其套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一株植物乳桿菌及其套用
• 公告號：CN105132322A
• 授權日：2015年12月9日
• 申請號：2015105598995
• 申請日：2015年9月2日
• 申請人：廣州格拉姆生物科技有限公司
• 地址：廣東省廣州市開發區開源大道11號科技企業加速器A8棟3樓
• 發明人：張宏剛、李莉
• Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I; A01P1/00(2006.01)I; A23K1/16(2006.01)I; C12R1/25(2006.01)N
• 代理機構：廣州嘉權專利商標事務所有限公司
• 代理人：胡輝
• 類別：發明專利
• 生物保藏 ：CGMCC No.11156 20150723

專利背景

在養殖技術領域中，抗生素的使用能夠有效地預防動物疾病，降低動物死亡率，減少肉品污染的風險。但是，其在動物飼料中的濫用造成動物性食品抗生素殘留超標，使動物和人體存在對抗生素產生耐藥性的風險。歐盟自2006年起將全面禁止食品動物食用抗生素促生長飼料添加劑，而且，抗生素對動物和人類的健康造成的風險也已引起我國農業部門的重視。加強管理養殖環節抗生素的合理使用和畜禽食品中抗生素殘留超標，成為食品安全領域關注的熱點。

益生菌是動物腸道內的正常菌群，對動物體沒有毒副作用。其附著在動物腸道內，一方面產生一些抑制病原菌生長的物質，另外在生長代謝過程中，可以分泌多種酶類，促進動物對飼料的消化吸收，提高料肉比，促進動物健康生長。因此益生菌製劑成為中國國內外業界研究的熱點。

植物乳酸桿菌屬於乳酸桿菌屬，革蘭氏陽性菌，最適生長溫度為30～37攝氏度，兼性厭氧，最適pH6.5左右。植物乳桿菌與人類的生活關係密切，是一種常見於奶油、肉類及許多蔬菜發酵製品中的乳酸菌，能通過胃並定植於腸道發揮有益作用。它對腸道微生物有重要影響，無論在食品發酵，還是在工業乳酸發酵以及飼料添加劑等領域，都有著廣泛的套用。

發明內容

專利目的

《一株植物乳桿菌及其套用》的目的是提供一株植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GLM101。

《一株植物乳桿菌及其套用》的另一目的在於提供上述植物乳桿菌在製備飼料添加劑中的套用。

技術方案

《一株植物乳桿菌及其套用》申請人將菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏中心於2015年7月23日收到申請人提供的菌株。保藏中心給予該培養物的保藏號為CGMCCNo.11156，建議的分類命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，已於2015年7月23日鑑定保藏的菌株是存活的。

有益效果

《一株植物乳桿菌及其套用》提供了一株植物乳桿菌GLM101，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、創傷弧菌和嗜水氣單胞菌具有顯著的抑制作用；具有較好的耐酸性，可在pH2.0的條件下生存；具有耐膽鹽能力，在1～3‰膽鹽條件下能夠生長。

《一株植物乳桿菌及其套用》的提供的一株植物乳桿菌可用於製備飼料添加劑，並適合應於畜禽、水產養殖的全過程。菌株GLM101能夠有效的提高保育豬的生產性能，也能明顯提高豬群的健康水平，減少抗生素及其他藥物的使用，節省成本。

《一株植物乳桿菌及其套用》植物乳桿菌可用於調節動物腸內微生態平衡，具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、促進動物生長和提高飼料轉化率。

技術領域

《一株植物乳桿菌及其套用》涉及一株新菌種及其套用，具體涉及一株植物乳桿菌GLM101的分離鑑定，及其在抑菌劑及飼料添加劑中的套用。

權利要求

1.植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其分類命名為Lactobacillus plantarum GLM101，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.11156。

2.權利要求1所述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GLM101在抑菌中的套用。

3.權利要求1所述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GLM101在製備飼料添加劑中的套用。

4.一種製備植物乳桿菌固體發酵產品的方法，其特徵在於：該方法為將權利要求1所述的植物乳桿菌菌種按2～4％的接種量接種到高密度固態發酵培養基中，於30～37攝氏度的條件下密閉發酵，再將發酵產物於45～60攝氏度烘乾，即可；所述高密度固態發酵培養基的配方為麥麩15%～25%，豆粕19%～29%，甘蔗糖蜜1%～3%，活性炭1%～3%，碳酸鈣2%～4%，β-環狀糊精2%～6%和水40%～50%，其中百分號為質量百分比。

5.根據權利要求4所述的一種製備植物乳桿菌固體發酵產品的方法，其特徵在於：所述高密度固態發酵培養基的配方為麥麩20%，豆粕24%，甘蔗糖蜜2%，活性炭2%，碳酸鈣3%，β-環狀糊精4%和水45%，其中百分號為質量百分比。

6.一種植物乳桿菌固體發酵產品，其特徵在於：其製備方法為權利要求4所述的方法。

7.權利要求6所述的一種植物乳桿菌固體發酵產品在製備飼料添加劑中的套用。

實施方式

• 實施例1 植物乳桿菌GLM101的分離、篩選、鑑定及保存

1.1菌株的分離

取健康仔豬糞便樣品，用無菌水分別進行10、100、1000倍稀釋，取200μL塗布於MRS固體培養基，37攝氏度培養48小時，挑取菌落，劃線MRS培養基，經4次純化後，挑取單菌落至MRS肉湯中培養至對數期，加入終濃度20％甘油，-80攝氏度下保存備用。經革蘭氏染色、觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗和16SrDNA測序。

1.2菌株形態學特徵鑑定

取純化菌株（命名為GLM101）的單菌落，轉接到MRS固體培養基（瓊脂）上，於37攝氏度恆溫培養箱中培養24h、36h和48h，分別觀察其菌落的大小、顏色、邊緣、凸起、光滑度、粘性、透明度等特點。結果顯示，菌株GLM101在MRS固體培養基上形成邊緣整齊，光滑，粘稠，表面光澤，不透明的菌落。在顯微鏡下觀察，為桿狀。

1.3菌株的生理生化特徵

挑取菌株GLM101在MRS固體培養基（瓊脂）上培養24h的新鮮培養物，進行生理生化測試。結果顯示，GLM101為革蘭氏陽性桿菌。

1.3.1API20NE鑑定特徵

利用法國梅里埃API20NE標準鑑定系統測定菌株GLM101利用碳源及產酸情況，API20NE試驗條是由20個含乾燥底物或培養基的小管所組成。

1）API20NEAUX培養基成分：（NH4）2SO42克，瓊脂1.5克，無機鹽基礎82.8毫克，胺基酸250毫克，維生素和營養物底物35.9毫克，磷酸緩衝液0.04M加至1000毫升，最終pH為7.0～7.2；

NaCl0.85％培養基：NaCl8.5克，H2O1000毫升。

2）在平板上培養菌株，以接種針從分離物的平板上挑取1～4份純單個菌落至2毫升含0.85％NaCl的培養基中，仔細研勻以達到均一的細菌懸液，所需濃度為0.5麥氏單位標準濁度。打開AUX培養基的安瓿管加入200μL（6～8滴）剩下的生理鹽水菌懸液至安瓿，仔細混勻，但要避免有氣泡產生。

3）鹽水菌懸液和接種的AUX培養基分別加入相應的試驗條小管，GLU，ADH和CIRE則用礦物油覆蓋。

4）蓋上培養盒，於30攝氏度培養24小時後觀察現象，結果如表1所示。

表1.菌株GLM101生化鑑定結果

表1

註：+：表示反應為陽性；-：表示反應為陰性；

從表1中可以看出，《一株植物乳桿菌及其套用》菌株可以葡萄糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、硝酸鉀、七葉靈、對硝基-D-甲基半乳糖為碳源。

1.3.2APIZYM鑑定特徵

利用法國梅里埃APIZYM系統，可系統和快速地研究菌株GLM101產酶能力，APIZYM試驗條是由20個小管所組成，它的底部是一個專門設計含有酶底物和緩衝液的支持物。步驟如下：

1）用2毫升無菌蒸餾水挑新鮮細菌培養物製備一個菌懸液，其混濁度在McFarlandNo5和No6之間。

2）用吸管接種，於試驗條的每個杯中接入2滴標本（65微升）。

3）接種後，於37攝氏度培養箱培養4小時。

4）培養後，加1滴ZYMA試劑和1滴ZYMB試劑。觀察顏色並記錄結果如表2所示：

表2.菌株GLM101生化鑑定結果

註：+：表示反應為陽性；-：表示反應為陰性；w:表示反應較弱。

從表2中可以看出，《一株植物乳桿菌及其套用》菌株GLM101具有產白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、β-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙醯-葡萄糖胺酶等功能。

1.4菌株的分子生物學鑑定

1）利用天跟細菌基因組提取試劑盒（TIANAMPBacteriaDNAKit）提取菌株GLM101的基因組DNA，步驟按廠家說明書要求所述。利用細菌通用引物27F，1492R擴增菌株16SrDNA片段。

2）如上所述的引物對序列為，1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

3）菌株的16SrRNA基因測序的結果如SEQIDNO.1。在NCBI上比對後發現其與模式菌株Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917（T）的相似性達到為99.93％，綜合菌株GLM101有關生理生化指標和分子生物學鑑定結果，結合其形態學特徵，我們將其命名為LactobacillusplantarumGLM101，於2015年年7月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCNO.11156。

1.5菌株的功能篩選

1.5.1耐酸性試驗。

實驗選取前期從健康仔豬腸道、植物、乳酪、市售同類產品等來源分離純化到乳酸菌菌株作為對照，經革蘭氏染色、觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗和16SrDNA測序等鑑定，這些乳酸菌菌株分別屬於糞腸球菌4株、屎腸球菌2株、發酵乳桿菌2株、乾酪乳桿菌2株、戊糖乳桿菌2株、植物乳桿菌5株、羅伊氏乳桿菌3株、鼠李糖乳桿菌3株、唾液乳桿菌2株、嗜酸乳桿菌1株。16SrDNA測序比對分析結果見下表3。

表3.相關分離所得乳酸菌菌株的鑑定結果

實驗方法：用HCl調節液體培養基至pH2.0。將菌種以的5％（V/V）的接種量分別接種上述各處理，37攝氏度靜置培養。在接種初始及接種後120分鐘取上述各處理中培養菌液，進行平板計數，從而計算出細菌的存活率，以pH6.0的菌液為對照。存活率（％）＝待測pH的菌液活菌數/pH6.0的菌液活菌數×100％。實驗結果見表4。

實驗結果：

表4.GLM101與其它分離菌株耐酸實驗對比結果

由實驗結果可知，所分離的菌株在pH2.0條件下時的存活率分別為1.2％～76.3％，其中菌株GLM101的存活率最高，達到76.3％。

進一步對菌株GLM101進行耐酸性檢測，實驗方法為：

設4個不同pH值處理，分別用HCl調節液體培養基至pH值為1.5、2.5、3.5、4.5。將菌種以的5％（V/V）的接種量分別接種上述各處理，37攝氏度靜置培養。在接種初始及接種後30、60、90、120、150分鐘取上述各處理中培養菌液，進行平板計數，從而計算出細菌的存活率，以pH6.0的菌液為對照。存活率（％）＝待測pH的菌液活菌數/pH6.0的菌液活菌數×100％。實驗結果見表5。

表5菌株GLM101耐酸實驗結果

由實驗結果可知，所分離的菌株在pH1.5、2.5、3.5、4.5時的存活率分別為2.1％、66.9％、88.0％、95.1％，說明該菌具有較強的耐酸性，最低可以耐受pH範圍為1.5～2.5。

1.5.2抑菌試驗

實驗菌株選取實驗室前期分離自植物、仔豬腸道、市售同類產品等來源的植物乳桿菌，指示菌株選取大腸桿菌（EscherichiacoliATCC8739）、金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC6538）、傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphiCMCC（B）50071）、創傷弧菌（VibriovulnificusATCC27562）和銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeru克inosaATCC9027）。採用牛津杯法，將指示菌株分別塗布於MRS瓊脂平板上，每杯加入0.2毫升培養24h的乳酸菌培養液，恆溫培養箱中培養，觀察培養結果，測定平皿內抑菌圈直徑大小，實驗結果見表6。

實驗結果：

表6.菌株GLM101抑菌實驗對比結果

註：實驗重複3次，結果為三次平均值。

由實驗結果可知，所分離的菌株對常見致病指示菌有良好的抑制作用，其中菌株GLM101對指示菌的抑菌能力都好與其它來源植物乳桿菌。

在抑菌試驗中，還檢測了《一株植物乳桿菌及其套用》菌株GLM101對綠膿桿菌的抑制作用，操作方法同上所述的牛津杯法，實驗結果顯示，菌株GLM101組產生了直徑為17.5毫米的抑菌圈，而對照組無抑菌圈出現，進一步說明《一株植物乳桿菌及其套用》分離的菌株GLM101對常見致病指示菌有良好的抑制作用。

1.5.3耐受膽鹽試驗。

實驗菌株選取實驗室前期分離自植物、仔豬腸道等來源的乳酸菌菌株（表3），菌株培養16h後，在4攝氏度12000克離心4分鐘後收集菌體，用PBS溶液沖洗2次。加入含有膽鹽0.7％（w/v）的PBS溶液中，37攝氏度培養4h後，稀釋至10-4濃度塗布MRS平板，37攝氏度厭氧培養48h後，觀察MRS平板上菌落生長情況。

結果顯示，在所有的實驗平板中，僅GLM101、GLM271、GLM274、GLM280、GLM321、GLM322、GLM344、GLM347菌落數超過長出1.0*108個菌群每毫升，其中菌株GLM101的存活量最高，達到3.8*108個菌群每毫升，具體結果見表7。

表7.各菌株經膽鹽0.7％（w/v）處理4h後的存活菌量

註：----表示存活乳酸菌菌落數≦1.0*106個菌群每毫升。

實施例2 菌株GLM101固體發酵產品的製備方法

1）菌種及其種子液製備

乳酸菌菌株GLM101在MRS瓊脂平板活化，挑取單菌落接種於MRS液體試管，37攝氏度培養24h後，以2％接種量轉接於MRS液體培養基，培養24後作為種子液。

MRS培養基主要成分是蛋白腖10.0克，牛肉膏10.0克，酵母膏5.0克，檸檬酸氫二銨2.0克，葡萄糖20.0克，吐溫801.0毫升，乙酸鈉5.0克，磷酸氫二鉀2.0克，硫酸鎂0.58克，硫酸錳0.25克，蒸餾水1000毫升，pH6.2～6.6。最適pH6.0，最適溫度37攝氏度，兼性厭氧。

2）接種

以3％v/v接種量將製備的種子液接種到配置的高密度固態培養基（含麥麩20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸鈣3％，β-環狀糊精4％和水45％，其中百分比均為質量百分比）。麥麩20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸鈣3％，β-環狀糊精4％和水45％

3）發酵

將接好菌種的培養基在30～37攝氏度下密閉發酵48h。然後將發酵產物在55攝氏度下烘乾4.1h，即得菌株GLM101固體發酵產品。

取上述發酵烘乾產品，梯度稀釋，塗布MRS培養基，厭氧培養48h後，計算菌落數，實驗結果顯示《一株植物乳桿菌及其套用》發酵烘乾產品中的活菌含量為3.6*1010CFU/克。

實施例3菌株GLM101固體發酵產品對保育豬生產性能的影響

3.1實驗動物與分組

選取32日齡斷奶仔豬216頭為實驗對象，其中實驗組、對照組各108頭，飼餵至77日齡。實驗從2013年3月4日開始至2013年4月18日結束，歷期45天。

3.2實驗設計

對照組1：基礎日糧不添加菌株GLM101固體發酵產品；

對照組2：基礎日糧添加0.1％市場某同類產品；

實驗組：基礎日糧中添加0.1％（質量百分比）菌株GLM101固體發酵產品，實驗詳細設計如表8所示。

表8.日糧結構

3.3、結果與分析

（1）發酵菌株對保育豬體重增加的影響

體重增加情況如表9所示，實驗組初重8.99千克/頭，末重25.41千克/頭，日增重364.89克；對照組初重9.08千克/頭，末重25.14千克/頭，日增重356.89克。實驗組日增重比對照組1多8.00克，在實驗期間頭均淨增重多0.36千克。

表9.發酵菌株對保育豬體重增加的影響

（2）菌株GLM101對保育豬育成率的影響

保育豬育成率情況如表10所示，實驗組選取108頭仔豬，實驗期間淘汰4頭，死亡1頭，實驗結束時存欄103頭，育成率為95.37％；對照組選取108頭斷奶仔豬，實驗期間淘汰4頭，死亡5頭，實驗結束時存欄99頭，育成率為91.67％。實驗組比對照組育成率明顯提高。

表10發酵菌株對保育豬育成率的影響

（3）菌株GLM101對保育豬料肉比的影響

保育階段的耗料情況如表11所示，在保育階段，實驗組的頭均增重為16.42千克，頭均耗料為30.37千克，料肉比為1.85。實驗組比對照組的料肉比相比顯著下降。

表11發酵菌株對保育階段料肉比的影響

3.4、效果討論與說明

本實驗表明實驗組每頭保育豬較基礎飼料對照組平均體重提高了0.36千克，平均日增重提高了8.0克，死亡淘汰率降低了3.70％，料肉比降低了0.47。實驗證明，菌株GLM101能夠有效的提高保育豬的生產性能，且顯著優於對比的市場同類產品。另外菌株GLM101的使用能明顯提高豬群的健康水平，可減少抗生素及其他藥物的使用，同樣可以節省成本。

綜上所述，《一株植物乳桿菌及其套用》植物乳桿菌可用於調節動物腸內微生態平衡，具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、促進動物生長和提高飼料轉化率。

上述實施例為《一株植物乳桿菌及其套用》較佳的實施方式，但《一株植物乳桿菌及其套用》的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離《一株植物乳桿菌及其套用》的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在《一株植物乳桿菌及其套用》的保護範圍之內。

榮譽表彰

2018年12月20日，《一株植物乳桿菌及其套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。