一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》是江南大學於2012年9月3日申請的專利，該專利的公布號為CN102827796A，授權公布日為2012年12月19日，發明人是陳衛、田豐偉、翟齊嘯、王剛、劉小鳴、張秋香、范大明、趙建新、張灝。

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》的植物乳桿菌CCFM8610具有耐酸性，在體外對鎘離子有良好的耐受能力和吸附能力，能降低鎘暴露小鼠肝臟和腎臟中的鎘含量，並具有促進鎘暴露小鼠通過糞便排鎘的作用。所述的植物乳桿菌CCFM8610用於具有排鎘功能的藥物組合物與發酵食品，具有非常廣泛的套用前景。

2015年11月27日，《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》獲得第十七屆中國專利獎金獎。

基本介紹

中文名：一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途
申請人：江南大學
申請日：2012年9月3日
申請號：2012103221242
公布號：CN102827796A
公布日：2012年12月19日
發明人：陳衛、田豐偉、翟齊嘯、王剛、劉小鳴、張秋香、范大明、趙建新、張灝
地址：江蘇省無錫市濱湖區蠡湖大道1800號
Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I、A61K35/74(2006.01)I、A61P39/02(2006.01)I、A23C9/12(2006.01)I等
代理機構：北京君智智慧財產權代理事務所
代理人：向華
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

鎘是一種對人體健康極其有害的重金屬，在環境中非常穩定，為已知的最易在體內蓄積的毒物。鎘可溶於水，它與氧、氯、硫等元素生成無機化合物分布於自然界中，並被廣泛套用於電鍍、電池、合金、顏料、塑膠等的各個技術領域。隨著鎘在工業和生活中的套用，其在水體和土壤中的含量逐年增加，繼而在一些植物或動物體內蓄積（如鎘污染區的大米、菸草、貝殼類海鮮、動物肝腎臟等），最終通過食物鏈在人體內蓄積。鎘污染情況在亞洲國家尤為嚴重，1955年日本爆發了震驚世界的痛痛病事件，其病因就是由於神通川水域遭受鎘污染，導致居民食用的大米中鎘嚴重超標。在中國，每年由工業廢棄物排放到環境中的鎘總量約680餘噸，鎘已經成為水源和耕地最主要的污染源之一。中國科學院地理科學與資源研究所環境修復研究中心主任陳同斌指出，中國受鎘污染的耕地達到8000萬畝左右，在一些污染嚴重的地區，稻田有效鎘含量甚至是國家允許值的26倍。2002年農業部對全國市場稻米的抽查表明10%左右的市售大米鎘含量超標，2007年南京農業大學潘根興教授和他的研究團隊在中國六個地區（華東、東北、華中、西南、華南和華北）縣級以上市場的抽樣調查再次證明了這一結果。

鎘具有毒性強、潛伏期長的特點。1997年以來，美國毒性物質與疾病登記署（ATSDR）和環境保護署（EPA）一直將鎘列為第六位危害人類健康的有毒物質，其對人體的危害主要涉及到骨骼、腎臟、肝臟、呼吸系統、血液系統及生殖器官，另外鎘還是致癌物，在1993年即被國際抗癌聯盟列為IA級致癌物。急性鎘中毒導致人體出現咳嗽、胸悶、呼吸困難、噁心、嘔吐及腹痛等症狀，攝入大劑量鎘甚至會由於急性肝損傷而導致死亡。慢性鎘中毒涉及腎損傷（蛋白尿、腎結石、慢性腎衰竭）、骨損傷（骨痛、骨質疏鬆、骨軟化、自發性骨折）、生殖器官損傷（睪丸、卵巢損傷）及癌症（肺癌、前列腺癌）。鎘進入人體後生物學半衰期長達10到30年，其隱蔽性和滯後性往往容易被人忽視。

對於由鎘中毒引起的各種生理病症，通常使用依地酸二鈉鈣、二巰基丁二酸鈉等螯合劑進行注射治療，以達到排鎘的目的，例如中國藥典第二版（2000年）記載了依地酸二鈉鈣作為鎘和鉛等重金屬中毒的解毒劑。然而，這些藥物都存在著一定的毒副作用。依地酸二鈉鈣是一種廣譜性絡合劑，具有較強的腎毒性，且用藥時會經尿排出大量人體不可缺少的微量元素，例如鋅、銅、錳、鐵等，而這些元素與很多酶的活性有關，因此大量使用依地酸二鈉鈣會危及人的身體健康。二巰基丁二酸鈉可能導致消化系統功能紊亂，並造成頭痛、噁心、四肢酸痛等症狀，同時必須在攝入鎘之後極短時間之內給藥，否則不能得到良好的療效（Kojima，S.，Sugimura，et.al，“Effectsofdithiocarbamatesontesticulartoxicityinratscausedbyacuteexposuretocadmium”，《Toxicologyandappliedpharmacology》，116，24-29（1992））。

鑒於傳統治療方法存在的多種問題，針對鎘中毒尋找一種新的干預或治療方法顯得十分必要。乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發酵並產生乳酸的細菌的統稱，廣泛存在於自然發酵乳製品、發酵植物食品，如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。長期科學研究結果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢復人體腸道內菌群平衡維護人體健康、抗腫瘤和預防癌症作用、控制人體內毒素水平、保護肝臟並增強肝臟的解毒等功能。乳酸菌作為一種食品級的微生物，不像螯合劑有嚴重的毒副作用，且已有報導表明其在體外對鎘、鉛等重金屬離子具有較好的吸附作用（Halttunen，T.，Collado，M.C.，et.al，“Combiningstrainsoflacticacidbacteriamayreducetheirtoxinandheavymetalremovalefficiencyfromaqueoussolution”《LettersinAppliedMicrobiology》，46，160-165（2007）），因此很有潛力成為具有排鎘功能的新型保健食品。

2012年前，一些專利或專利申請文獻涉及排鎘保健食品及其製備方法，例如CN1336208公開了一種由脫臭大蒜粉、醋粉、冰明粉等製成的保健食品，經常食用可有效排除人體因空氣、水、農藥污染而累積超標的鎘；CN1328845公開了一種由土茯苓、紅參、三七等配方製成的中藥製劑，可有效治療和預防鎘中毒且長期服用無毒副作用。但是，2012年前涉及具有排鎘功能的乳酸菌專利申請檔案不多，例如CN101153272公開了一種伯克霍爾德氏菌J62，它對鎘具有高耐受性，可套用於環境工程技術領域中促進植物生長，強化植物富集重金屬鎘，提高植物提取修復效率。另外，CN101252943A公開了一些植物乳桿菌，它用於促進哺乳動物吸收鐵、鋅、鈣、鎂離子。

因此，篩選出一種具有對鎘具有優良耐受和吸附能力的乳酸菌，並且證明它們在動物模型中具有良好的排鎘作用，同時研製這些乳酸菌實際的用途就顯得十分必要。該發明試圖進一步地挖掘益生菌的功能，開發具有更高保健價值的乳酸菌，為利用膳食策略緩解鎘中毒效應開闢出新的途徑和解決方案。

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》的發明人在總結2012年9月之前技術的基礎上，通過大量實驗研究，終於完成了該發明。

發明內容

專利目的

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》的目的是提供一種植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）CCFM8610。該發明的另一個目的是提供所述植物乳桿菌CCFM8610的用途。

技術方案

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》涉及一種乳酸菌，利用形態特徵、培養性狀和生理生化特徵等微生物學特性對該乳酸菌鑑定為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）CCFM8610，該菌株已於2012年5月3日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo.6077。

所述的植物乳桿菌CCFM8610具有下述性質：

⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好；

⑵在體外含鎘培養基中培養，對鎘離子有良好的耐受能力；

⑶在體外含鎘水溶液中孵育，對鎘離子有良好的吸附能力；

⑷具有降低鎘暴露小鼠體內鎘含量和促進鎘暴露小鼠通過糞便排鎘的作用。

該發明還涉及所述的植物乳桿菌CCFM8610在製備緩解鎘中毒的藥物組合物與發酵食品中的用途。

根據該發明的一種優選實施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM8610菌劑與在藥學上可接受的載體組成的。

根據該發明的另一種優選實施方式，所述的植物乳桿菌CCFM8610菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8610的菌液通過常規冷凍乾燥工藝製備或其它方法製備所得到的粉劑，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8610。

根據該發明的另一種優選實施方式，在藥學上可接受的載體是一種或多種選自在藥學上通常使用的填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑或矯味劑的載體。

根據該發明的另一種優選實施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液劑型。

根據該發明的另一種優選實施方式，所述的發酵食品是使用含有植物乳桿菌CCFM8610菌種的發酵劑生產的乳製品、豆製品與果蔬製品。

根據該發明的另一種優選實施方式，所述的發酵劑是通過下述製備步驟得到的：

A、培養基的製備：使用以所述培養基總重量計87.7%水將10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白腖與0.3%酵母浸膏溶解，然後調整其pH為6.8，這樣得到所述的培養基；

B、保護劑的製備：使用水與保護劑原料混合製備得到含有100克/升脫脂奶粉、30毫升/升甘油、100克/升麥芽糊精、150克/升海藻糖、10克/升L-谷氨酸鈉的保護劑；

C、將植物乳桿菌CCFM8610菌種按照以所述培養基的重量計2-4%接種量接種到在溫度110-120℃下滅菌8-12分鐘的所述培養基中，在溫度37℃下培養18小時，用pH7.2磷酸鹽緩衝液清洗2-4次，用所述保護劑重懸達到濃度10CFU/毫升；接著，讓該懸浮液在溫度37℃下預培養60分鐘，再進行冷凍乾燥得到所述的發酵劑。

根據該發明的另一種優選實施方式，所述的乳製品是牛奶、優酪乳油或乾酪；所述的豆製品是豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬製品是黃瓜、胡蘿蔔、甜菜、芹菜或圓白菜製品。

該發明涉及一種植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）CCFM8610，該菌株已於2012年5月3日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo.6077。該發明人根據下述篩選標準，通過大量篩選實驗與分析驗證，從中國傳統食品，例如泡菜，發酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）CCFM8610具有下述性質:

⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好；

⑵在體外含鎘培養基中培養，對鎘離子有較好的耐受能力；

⑶在體外含鎘水溶液中孵育，對鎘離子有良好的吸附能力；

⑷具有降低鎘暴露小鼠體內鎘含量和促進鎘暴露小鼠通過糞便排鎘的作用。

下面將詳細描述這些實驗與分析認證結果。

1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好

將冷凍保存的該發明植物乳桿菌CCFM8610分別接種於MRS培養基（例如青島海博生物技術有限公司的產品）中，在溫度37℃下培養24小時，再經MRS培養液傳代培養2～3次後，取1毫升植物乳桿菌CCFM8610培養液，分別接種於19毫升不同pH值（3.0-9.0）的MRS液體培養基中，在溫度37℃下培養24小時，測定初始和培養結束後的OD₆₀₀值，利用這個值測量在細菌培養液中的細胞濃度，從而估計細菌的生長情況。OD₆₀₀值是採用分光光度法在波長600納米處測定的細菌培養液的吸光值，它通常用於表示在細菌培養液中細胞濃度，以確定液體培養物中細菌的生長情況。

試驗結果證明植物乳桿菌CCFM8610在pH3.0-9.0的環境中生長良好，因此得以進行後續實驗。採用與前面所述的同樣培養方式，用1.0毫升pH7.2PBS（磷酸鹽緩衝液）清洗菌體兩次，再用1.0毫升pH7.2磷酸鹽緩衝液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.0毫升pH2.5人工胃液混合，然後在溫度37℃下進行培養，分別在開始（0小時）和3小時時取樣，用MRS瓊脂培養基澆注培養進行平板菌落計數，測定活菌數並計算其存活率。存活率是在該培養液中在第3小時時的活菌數對數值與在第0小時時活菌數對數值之比，以%表示。該發明篩選存活率在80%以上的菌株進行後續研究。實驗結果表明，植物乳桿菌CCFM8610在pH2.5的人工胃液環境中的存活率在90%以上。由此可見，植物乳桿菌CCFM8610具有耐酸性，在pH2.5的環境下存活良好。

2、在體外含鎘培養基中培養，對鎘離子有良好的耐受能力

通過植物乳桿菌CCFM8610在不同鎘含量培養基中的生長曲線可以研究其在體外對鎘離子的耐受能力。在無菌條件下，向1升水中加入0.3423克3CdSO₄·8H₂O，即得到濃度為150毫克/升的鎘離子水溶液。使用這種鎘離子水溶液溶解MRS固體培養基幹粉得到含150毫克/升鎘離子的MRS液體培養基。同樣地，分別配製50毫克/升、500毫克/升鎘離子濃度的MRS液體培養基。按照以含鎘離子的MRS液體培養基重量計2%接種量將進入穩定期的植物乳桿菌CCFM8610菌液接入所述含鎘離子的MRS液體培養基中。在其培養過程中，分別在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時時進行標準平板計數，從而得到如附圖1所示的植物乳桿菌CCFM8610生長曲線。附圖1的結果表明，該發明植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子的具有良好的耐受能力。

3、在體外含鎘水溶液中孵育，對鎘離子有良好的吸附能力

在無菌條件下，按照耐酸性（在pH3.0能夠生長）的篩選標準，從中國傳統食品，例如泡菜，發酵奶酒中篩選出9株乳酸菌。對這9株乳酸菌進行純化和活化培養後，將上述菌株轉移至150毫克/升鎘溶液中，使菌體最終濃度達到1克/升。將含有上述菌株的樣品在37℃下培養1小時，使用Beckman離心機以6000轉/分鐘離心20分鐘，再用無菌水洗滌、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20分鐘，得到的消解液使用原子吸收光譜分析儀（SpectrAA220，Varian，USA）測定鎘離子含量，以確定各菌株對鎘離子的吸附能力。這些測定結果列於附圖2中。附圖2清楚地表明，與其它試驗菌株相比，該發明植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子的吸附量最大，因此，對鎘離子具有良好的吸附能力。

4、具有降低鎘暴露小鼠組織內鎘含量和促進鎘暴露小鼠通過糞便排鎘的作用。

取20-25克健康雄性昆明小鼠60隻，隨機分為3組，每組含小鼠20隻：陰性對照組，鎘暴露模型對照組與植物乳桿菌CCFM8610治療組。試驗第一天，陰性對照組灌胃0.5毫升普通飲用水；其餘2組灌胃0.5毫升鎘濃度為3.6毫克/升的硫酸鎘溶液。第一次灌胃結束1小時後，陰性對照組和鎘暴露模型組灌胃0.5毫升脫脂乳，植物乳桿菌CCFM8610治療組灌餵0.5毫升按該說明書實施例3製備的濃度2.0×10CFU/mLCCFM8610脫脂乳懸液。在第一次灌胃結束48小時後處死所有小鼠，分別取肝、腎，消化處理後採用上述原子吸收分光光度法測定組織中的鎘含量。這些測定結果列於附圖3中。在第一次灌胃結束後的4小時，8小時，12小時，24小時和48小時分別採集小鼠的糞便，消化處理後測定糞便中的鎘含量。這些測定結果列於附圖4中。通過對鎘暴露模型組（僅灌胃鎘）及植物乳桿菌CCFM8610組治療組（灌胃鎘後1小時灌胃CCFM8610）小鼠體內肝臟、腎臟及糞便中的鎘含量的比較，發現該發明植物乳桿菌CCFM8610能夠降低小鼠肝臟、腎臟、中的鎘含量，並促進小鼠通過糞便將鎘排出。

該發明的植物乳桿菌CCFM8610具有下述生物學特性：

菌體特徵：呈革蘭氏染色陽性桿狀細菌，菌體約0.9-1.2微米寬，3-8微米長，不形成芽孢，兩端呈鈍圓形，參見附圖5。

菌落特徵：在MRS培養基上形成明顯的菌落，直徑在0.3-2.3毫米之間，正面形態圓形，側面形態呈突起狀，邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤光滑，不產生色素，參見附圖6。

生長特性：該菌株的最低生長溫度為12℃，最高生長溫度為43℃，在溫度30-37℃下生長最佳，最高和最低初始生長pH為9.0和2.5，最適生長初始pH為6.0；該發明植物乳桿菌CCFM8610菌株的延遲期相對較短，4小時左右開始進入對數生長期，16小時就達到穩定期。

該發明植物乳桿菌保存方法：所述植物乳桿菌CCFM8610原始菌種在溫度-75℃下以30%重量百分數的甘油懸液形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用。該發明植物乳桿菌CCFM8610培養方法與培養條件：在MRS培養基中在兼性厭氧條件與溫度37℃的條件下培養18-36小時即可使用。該發明還涉及所述的植物乳桿菌CCFM8610在製備具有排鎘作用的藥物組合物與發酵食品中的用途。所述的藥物組合物是植物乳桿菌CCFM8610菌劑與在藥學上可接受的載體組成的。

根據該發明，所述的植物乳桿菌CCFM8610菌劑是採用通常的冷凍乾燥製備技術將含有所述的植物乳桿菌的菌液製成的凍乾粉劑，或是採用其它方法如噴霧乾燥法製備得到的粉劑。所述的植物乳桿菌CCFM8610菌劑含有106CFU/mL以上的活性植物乳桿菌CCFM8610。植物乳桿菌CCFM8610含量測定方法是該技術領域的技術人員熟知的MRS平板菌落計數法。在所述的藥物組合物中，所述植物乳桿菌CCFM8610菌劑的量是所述藥物組合物重量的15-35%，優選地是18-32%，更優選地是20-30%。

根據該發明，在藥學上可接受的載體應該是指在藥學領域中的常規藥物載體，例如是一種或多種選自在藥學上通常使用的填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑或矯味劑的載體。根據該發明，所述的填充劑應該理解是用來增加片劑重量和體積而便於壓片的輔料稀釋劑；或者應該理解是用以吸收原料中多餘液體成分的輔料吸收劑。所述的填充劑選自澱粉、蔗糖、乳糖、硫酸鈣或微晶纖維素。優選地，所述的填充劑選自澱粉、蔗糖或微晶纖維素。更優選地，所述的填充劑選自澱粉或微晶纖維素。根據該發明，所述的潤濕劑應該理解是藥物本身無粘性，但可潤濕其藥物原輔料並誘發其粘性而製成顆粒的液體。所述的潤濕劑選自水、乙醇、澱粉或糖漿。優選地，所述的潤濕劑選自水、乙醇或澱粉。

該發明使用潤濕劑的量是以所述藥物組合物總重量計0.1-3.0%。根據該發明，所述的粘合劑應該理解是當原料藥物本身無粘性或粘性不足時，需加入粘性物質以便於制粒，這種粘性物質稱為粘合劑。所述的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。優選地，所述的粘合劑選自纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。更優選地，所述的粘合劑選自明膠或聚乙烯吡咯烷酮。該發明使用粘合劑的量是以所述藥物組合物總重量計0.5-5.0%。根據該發明，所述的崩解劑應該理解是一種能夠加入片劑中而促進其片劑在胃腸液中快速崩解成細小粒子的輔料。人們知道，片劑經過壓縮後的硬度大，如果其中不含有可以促進崩解作用的輔料，它在胃腸道中崩解很慢，影響療效。所述的崩解劑選自羧甲基澱粉鈉、羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉。優選地，所述的崩解劑選自羧甲基澱粉鈉、羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素、瓊脂或碳酸氫鈉。更優選地，所述的崩解劑選自羧甲基澱粉鈉、羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素或碳酸氫鈉。

該發明使用崩解劑的量是以所述藥物組合物總重量計5.0-15.0%。根據該發明，所述的潤滑劑應該理解是一種有利於提高片劑在制粒過程中的流動性，防止片劑材料粘附在製片機模子上，有利於片劑脫模的化學物質。所述的潤滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉矽膠或聚乙二醇。優選地，所述的潤滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇。更優選地，所述的潤滑劑選自滑石粉或硬脂酸鈣。該發明使用潤滑劑的量是以所述藥物組合物總重量計0.5-3.0%。根據該發明，所述的矯味劑應該理解是在藥品中用以改善或禁止藥物不良氣味和味道，使病人難以覺察藥物強烈苦味或其它異味，例如辛辣、刺激等的藥用輔料。所述的矯味劑例如選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬、茴香或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；檸檬酸、酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。優選地，所述的矯味劑選自單糖漿、蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。更優選地，所述的矯味劑選自蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬油芳香劑；海藻酸鈉或阿拉伯膠的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。

該發明使用矯味劑的量是以所述藥物組合物總重量計0.5%-2.0%。該發明的植物乳桿菌CCFM8610菌劑可以與在藥學上可接受的載體或賦形劑組合製成各種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液，其中在藥學上可接受的載體或賦形劑可以根據不同劑型進行選擇，所使用的這些載體或賦形劑及其用量對於製藥技術領域的普通技術人員都是容易確定的，也是顯而易見的。在該發明中，採用製藥技術領域的普通技術人員熟知的普遍使用的方法和設備製備該發明藥物顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。所述的“劑型”一般應該理解是適用於人的單劑量藥物形式，單個劑型含有為達到所需藥量的預定活性物質，例如該發明的植物乳桿菌CCFM8610菌劑。在該發明中，所述的發酵食品是使用含有植物乳桿菌CCFM8610菌種的發酵劑生產的乳製品、豆製品與果蔬製品。。

所述發酵劑的製備方法如下：

B、保護劑的製備：使用水與保護劑原料製備得到含有100克/升脫脂奶粉、30毫升/升甘油、100克/升麥芽糊精、150克/升海藻糖、10克/升L-谷氨酸鈉的保護劑；

C、植物乳桿菌CCFM8610按照以所述培養基的重量計2-4%接種量接種到在溫度110-120℃下滅菌8-12分鐘的所述培養基中，然後在溫度37℃下培養18小時，用pH7.2磷酸鹽緩衝液清洗2-4次，用所述保護劑重懸達到濃度10CFU/毫升；接著，讓該懸浮液在溫度37℃下預培養60分鐘，再採用凍乾法製成所述的發酵劑。

所述的乳製品是牛奶、優酪乳油或乾酪。在該發明中，所述的牛奶應該理解是牛乳、馬乳或還原乳。所述的還原乳是用以還原乳總重量計10-15%奶粉與85-90%軟化水配製的。所述的奶粉是2012年前市場上廣泛銷售的產品。所述的優酪乳油是稀奶油經乳酸菌發酵製成的奶油。優酪乳油比甜奶油有更多的優越性，香味更濃郁，奶油產量也更高；另外由於乳酸菌抑制了有害微生物，所以消毒殺菌後再次污染微生物的風險也較低。所述的乾酪是由牛奶經發酵製成的一種營養價值很高的食品。所述的豆製品是豆奶、豆豉或豆醬。它們都是中國的傳統食品或調味品。所述的果蔬製品是黃瓜、胡蘿蔔、甜菜、芹菜或圓白菜製品。在生產乳製品、豆製品與果蔬製品時，按照下述方法使用該發明的植物乳桿菌CCFM8610菌劑發酵劑：

通常，在生產乳製品、豆製品和果蔬製品的常規生產過程中，把該發明的植物乳桿菌CCFM8610菌劑發酵劑按照常規使用量接種到待處理的原料中，在能夠使所述植物乳桿菌CCFM8610繁殖的溫度、壓力下進行發酵或存活，其代謝產物使發酵製品具有一定的酸度、香味等優異特性，同時使產品延長了保藏時間，改善了產品營養價值和消化性。

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》的植物乳桿菌CCFM8610具有耐酸性，在體外對鎘離子有良好的耐受和吸附能力，可降低小鼠肝臟和腎臟中的鎘含量，並促進小鼠通過糞便將鎘排出體外。所述的植物乳桿菌CCFM8610可用於製備具有排鎘功能的藥物組合物與發酵食品，具有非常廣泛的套用前景。

附圖說明

圖1是植物乳桿菌CCFM8610於含起始濃度為50毫克/升，150毫克/升，500毫克/升的鎘離子培養基中的生長曲線；

圖2是9株乳酸菌對鎘離子的吸附情況。其中：CCFM8610，CCFM8614和CCFM8661為植物乳桿菌。CCFM8761為羅伊氏乳桿菌。CCFM8004為保加利亞乳桿菌。CCFM8602為加氏乳桿菌。LGG為鼠李糖乳桿菌。CCFM8622為兩歧雙歧桿菌。CCFM8147為德氏乳桿菌。

圖3是植物乳桿菌CCFM8610對鎘暴露小鼠肝臟和腎臟中鎘水平的降低作用；a，b，c表示不同字母所代表的組別都存在顯著性差異（P<0.05）。

圖4是植物乳桿菌CCFM8610促進小鼠通過糞便排鎘的作用；a，b表示不同字母所代表的組別都存在顯著性差異（P<0.05）。

圖5是植物乳桿菌CCFM8610的菌體形態（1000×）。

圖6是植物乳桿菌CCFM8610的菌落形態。

技術領域

《一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途》屬於微生物技術領域。更具體地，該發明涉及一種具有排鎘功能的植物乳桿菌，該發明還涉及所述植物乳桿菌的用途。

實施方式

實施例1：植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子的耐受能力實驗

在無菌條件下，向1升水中加入0.3423克3CdSO₄·8H₂O，得到150毫克/升的鎘離子水溶液。使用這種鎘離子水溶液溶解MRS培養基固體配料，得到含150毫克/升鎘離子的MRS液體培養基。MRS培養基是該技術領域的技術人員熟知的培養基，它含有胰蛋白腖、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸鈉、檸檬酸二銨、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳，pH6.2～6.4。

以與前面描述的同樣方式配製含有50毫克/升與500毫克/升鎘離子濃度的MRS液體培養基。將進入穩定期的植物乳桿菌CCFM8610按照以含鎘的MRS液體培養基重量計2%接種量接種於所述的含鎘MRS液體培養基中，在37℃條件下進行培養，分別在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時時取樣，進行標準平板計數，得到如附圖1所示的植物乳桿菌CCFM8610生長曲線。另外，將1毫升所述的菌液接入不含鎘的MRS液體培養基中，在同樣條件下進行培養並計數，其結果作為空白對照結果，這些試驗結果也列於附圖1中。

由附圖1可以看出，在三個不同鎘離子濃度下，植物乳桿菌CCFM8610雖然在開始時生長受到抑制，但隨後其生長量迅速增加。24小時時，CCFM8610在50毫克/升與150毫克/升鎘離子濃度中的生長量已經接近了空白對照組。因此，其結果表明植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子具有良好的耐受能力。

實施例2：植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子的吸附能力實驗

按照耐酸性（在pH3.0環境中能夠生長）的篩選標準，從中國傳統食品，例如泡菜，發酵奶酒中篩選出9株乳酸菌，將這9株乳酸菌在無菌條件下使用MRS培養基進行純化和活化。將這些活化菌液振盪均勻，以轉速6000轉/分鐘進行離心15分鐘。得到的菌體轉移到裝有150毫克/升鎘離子濃度溶液的容器中，而空白組則轉移到去離子水中。根據菌體質量確定藍蓋瓶中液體的體積，使菌體的最終濃度達到1克/升。將以上樣品於溫度37℃下培養1小時。使用Beckman離心機以轉速6000轉/分鐘離心20分鐘，再用無菌水洗滌、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20分鐘，得到的消解液使用該申請說明書描述的原子吸收光譜分析儀與方法測定鎘離子含量，以確定不同菌株吸附鎘離子的能力。

其試驗結果如附圖2所示。由附圖2可以看出，不同的菌種對鎘離子的吸附能力差異較大。其中植物乳桿菌CCFM8610的吸附能力最強，可吸附10.92毫克/克鎘離子，而德氏乳桿菌CCFM8147對鎘離子的吸附能力較差，只能吸附3.22毫克/克的鎘離子，其吸附能力遠低於該發明的植物乳桿菌CCFM8610。

實施例3：植物乳桿菌CCFM8610灌餵小鼠的耐受劑量實驗

將植物乳桿菌CCFM8610凍乾菌粉重懸於脫脂乳中，製成濃度為2.0×10cfu/mL的懸液。取約20克健康雄性昆明小鼠10隻，每日給予該濃度懸液灌胃一次，觀察一周，記錄死亡和體重情況。

這些試驗結果列於表1中。這些結果表明，餵食濃度2.0×10cfu/mL的植物乳桿菌CCFM8610未對小鼠造成明顯影響，體重明顯上升，無死亡現象產生。小鼠外觀無明顯病理症狀。

表1：餵食濃度2.0×10cfu/mL的植物乳桿菌CCFM8610對小鼠體重的變化情況

時間（天）	1	2	3	4	5	6	7
體重（克）	22.3±2.9	22.9±1.3	23.1±2.2	23.2±2.1	23.6±0.9	24.6±1.1	25.0±1.2
死亡情況	-	-	-	-	-	-	-

註：-：小鼠無死亡

實施例4：植物乳桿菌CCFM8610對鎘暴露小鼠肝臟和腎臟中鎘水平的降低作用

這些試驗結果如附圖3所示。通過對鎘暴露模型組（僅灌胃鎘）及植物乳桿菌CCFM8610組治療組（灌胃鎘後1小時灌胃CCFM8610）小鼠體內肝臟和腎臟中的鎘含量的比較可以發現，該發明的植物乳桿菌CCFM8610治療組中小鼠肝臟和腎臟中的鎘含量均比陰性對照組高，但低於鎘暴露模型對照組。肝臟和腎臟是鎘攻擊機體的靶器官，也是鎘最易在機體中蓄積的兩個器官。在鎘暴露後一小時內灌胃CCFM8610可使小鼠肝臟和腎臟中的鎘含量明顯降低，均具有顯著性（P<0.05），這也說明植物乳桿菌CCFM8610確實具有降低鎘暴露小鼠體內鎘含量的作用。實施例2已經表明植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子有較強的吸附能力，CCFM8610進入機體後可能迅速吸附鎘離子，從而阻止鎘離子被腸道吸收進入血液和組織。

實施例5：植物乳桿菌CCFM8610促進鎘暴露小鼠通過糞便排鎘的作用

這些試驗結果如附圖4所示，陰性對照組糞便中無法檢測到鎘，因此在圖中沒有顯示。通過對鎘暴露模型組（僅灌胃鎘）及植物乳桿菌CCFM8610組治療組（灌胃鎘後1小時灌胃CCFM8610）小鼠不同時間段糞便中的鎘含量比較可以發現，該發明的植物乳桿菌CCFM8610治療組中的小鼠在8小時，12小時及24小時糞便中的鎘含量均比鎘暴露模型組要高，且具有顯著性（P<0.05），這也說明植物乳桿菌CCFM8610確實具有促進鎘暴露小鼠排鎘的作用。實施例2已經表明植物乳桿菌CCFM8610對鎘離子有較強的吸附能力，CCFM8610進入機體後可能迅速吸附鎘離子，並通過糞便排出體外，從而達到排鎘的效果。

以上這些動物實驗表明，該發明植物乳桿菌CCFM8610能夠促進小鼠通過糞便排鎘，並顯著降低鎘暴露小鼠組織內的鎘含量。

套用實施例1：利用該發明植物乳桿菌CCFM8610製造含該菌的牛乳

按照下述步驟製備發酵劑：

A、培養基的製備：使用以所述培養基總重量計87.7%水將10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白腖與0.3%酵母浸膏溶解，然後調整其pH為6.8，這樣得到所述的培養基；所述的酶水解脫脂乳、葡萄糖、胰蛋白腖與酵母浸膏都是2012年前市場上銷售的產品。

B、保護劑的製備：使用水與保護劑原料製備得到含有100克/升脫脂奶粉、30毫升/升甘油、100克/升麥芽糊精、150克/升海藻糖、10克/升L-谷氨酸鈉的保護劑。

C、植物乳桿菌CCFM8610按照以所述培養基的重量計3%接種量接種到在溫度110-120℃下滅菌8-12分鐘的所述培養基中，然後在溫度37℃下培養18小時，用pH7.2磷酸鹽緩衝液清洗3次，用所述保護劑重懸達到濃度10CFU/毫升；接著，讓該懸浮液在溫度37℃下預培養60分鐘，再採用凍乾法製成所述的發酵劑。

將原料乳脫脂奶在95℃熱殺菌20分鐘，然後冷卻至4℃，再加入上述製備的植物乳桿菌CCFM8610發酵劑，使其濃度達到10CFU/毫升以上，在4℃下冷藏保存，於是得到含該發明植物乳桿菌CCFM8610活菌的牛乳。

套用實施例2：利用該發明植物乳桿菌CCFM8610製造含該菌的豆奶

採用軟水浸泡大豆，在溫度80℃下浸泡2小時，再去除大豆皮。接著，瀝去浸泡水，再加沸水磨漿，並在高於80℃的溫度條件下保溫12分鐘。得到的漿料用150目篩網過濾，接著進行離心分離，得到的離心液即為粗豆奶，再將它加熱到溫度140-150℃，然後將熱粗豆奶迅速導入真空冷卻室進行抽真空，所述粗豆奶中的異味物質隨著水蒸汽迅速排出。經過真空脫氣後，將其溫度降至約37℃，再接入該發明的植物乳桿菌CCFM8610工作發酵劑，使其濃度達到10CFU/毫升以上，在溫度4℃下冷藏保存，於是得到含該發明植物乳桿菌CCFM8610活菌的豆奶。

套用實施例3：利用該發明植物乳桿菌CCFM8610製造含該菌的果蔬飲料

選用新鮮蔬菜洗淨後榨汁，接著進行高溫瞬間滅菌，在溫度140℃下高溫熱殺菌2秒後，立即降溫到溫度約37℃，再接入該發明製備的植物乳桿菌CCFM8610菌劑發酵劑，使其濃度達到10CFU/mL以上，在溫度4℃下冷藏保存，於是得到含該發明植物乳桿菌CCFM8610活菌的果蔬飲料。

套用實施例4：製備含有該發明植物乳桿菌CCFM8610的膠囊製品

將該發明的植物乳桿菌CCFM8610在MRS培養基中培養24小時，在溫度4℃與4000轉/分鐘的條件下離心20分鐘，用pH7.2磷酸鹽緩衝液沖洗兩次，使用脫脂乳重懸菌體使最終菌體濃度達到2×10CFU/mL。將菌懸液加入到3重量%海藻酸鈉溶液中，充分攪拌，使得細胞均勻地分散於海藻酸鈉溶液中，然後將此混合液擠壓到2重量%氯化鈣溶液中形成膠粒，靜止固化30分鐘，過濾收集膠粒，將收集得到的膠粒進行冷凍乾燥48小時，得到含該發明植物乳桿菌CCFM8610的粉劑，把這種粉劑裝入到在2012年前市場上銷售的藥用膠囊中，得到所述的膠囊製品。

套用實施例5：使用該發明植物乳桿菌CCFM8610製備用於生產乳製品、豆製品以及果蔬製品的發酵劑

將植物乳桿菌CCFM8610按照以所述培養基重量計3%接種量接種於115℃溫度下滅菌10分鐘的培養基中，該培養基由以該培養基總重量計10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白腖、0.3%酵母浸膏和餘量水組成，pH6.8。然後，讓接種植物乳桿菌CCFM8610的培養基在溫度37℃下培養18小時，用pH7.2磷酸鹽緩衝液清洗兩次，再用保護劑重懸達到濃度10CFU/毫升。所述的保護劑含有100克/升脫脂奶粉、30毫升/升甘油、100克/升麥芽糊精、150克/升海藻糖與10克/升L-谷氨酸鈉。

接著，讓該懸浮液在溫度37℃下預培養60分鐘，再進行冷凍乾燥，得到所述的乳製品、豆製品以及果蔬製品的發酵劑。

套用實施例6：利用該發明植物乳桿菌CCFM8610製備發酵乳

鮮奶加糖溶解後，在溫度65℃與20兆帕條件下進行均質，然後在溫度95℃下保溫殺菌5分鐘，再將溫度降到溫度35℃，加入該發明植物乳桿菌CCFM8610、商業乾粉發酵劑保加利亞乳桿菌和商業乾粉發酵劑嗜熱鏈球菌組成的混合菌，它們的質量比例為1:1:1，所述混合菌的接種量為鮮奶重量的0.03％，混勻，在溫度35℃下保溫發酵，凝乳後，在溫度4℃下冷藏24小時，得到所述的發酵乳。

套用實施例7：利用該發明植物乳桿菌CCFM8610製備片劑

分別稱取採用冷凍乾燥方法製備的該發明植物乳桿菌CCFM8610菌粉製劑25.7重量份、澱粉55.0重量份、纖維素衍生物4.5重量份、羧甲基澱粉鈉12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份與水1.0重量份，混合，採用常規方法製成濕顆粒，然後使用中南製藥機械廠生產的壓片機進行壓片，然後使用青州市益康中藥機械有限公司生產的小型藥物乾燥機中進行乾燥，再包裝得到該發明的片劑。

榮譽表彰