《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》是楊雄於2014年6月13日申請的發明專利，該專利申請號為201410262552X，公布號為CN104293691A，公布日為2015年1月21日，發明人是楊雄。
《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》公開嗜酸乳桿菌的新菌株（Lactobacillus acidophilus）XD13R，其保藏號為CCTCC M 2014216，該菌株具有減少動物體內抗藥性細菌的比例的能力，可降低動物及人體對多種抗生素的抗藥性。同時，該發明還公開了該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑及方法，利用該生物製劑餵養畜禽動物可降低動物體內對不同抗生素抗藥性細菌比例30~96%。
2021年6月24日，《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑
- 申請人：楊雄
- 發明人：楊雄
- 申請號：201410262552X
- 申請日：2014年6月13日
- 公布號：CN104293691A
- 公布日：2015年1月21日
- 地址：廣東省廣州市天河區廣東省農科院西區22-803
- 代理機構：廣州知友專利商標代理有限公司
- 代理人：馬贇齋
- Int. Cl.：C12N1/20、A23K1/16、C12R1/23
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,實施案例,試驗案例,專利榮譽,
專利背景
在2014年前的20年裡，許多幾乎已經銷聲匿跡或普遍認為對人類健康不構成重大威脅的疾病好像結核和肺炎，隨著感染性疾病的爆發和耐藥菌株的增長及其在全球的重新蔓延，又一次向全人類的健康布下了蒼白的陰影。事實上，我們正在步入所謂的“後抗生素時代”——在抗生素被發現之前，人們經歷了無法控制感染類疾病的黑暗時代，2014年6月前已經有數種細菌對幾乎所有抗生素耐藥。中國是世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一，由此造成的細菌耐藥性問題尤為突出，臨床分離的一些細菌對某些藥物的耐藥性已居世界首位，尤其值得注意的是，人們對其危害性的了解遠遠不足夠。
所謂抗藥性又稱耐藥性，是指某種細菌對某種抗菌藥物反覆接觸後對抗菌藥物的反應降低，對某種抗生素不再敏感，抗生素對它們不再起作用的現象。是由於長期使用抗菌藥物，套用劑量不足時，細菌通過產生使藥物失活的酶、改變膜通透性阻滯藥物進入、改變靶結構或改變原有代謝過程而產生的。細菌耐藥性一旦形成，不論感染在哪個人的身上，抗生素都不能有效的殺滅或抑制它們。因此，耐藥細菌的危害會對整個人群健康構成威脅，而不是有人理解的那樣：“誰濫用，誰受害”。這個科學道理決非空穴來風誇大其詞，潛在的危害已經擺在了我們的面前。照此下去，人類將可能自食其果。
不僅如此，更為嚴重的是耐藥細菌可以從一個區域轉移到另一個地區或多個地區，從一個國家轉移到一個或多個國家，甚至從人傳給動物，動物傳給人，隨著人們交流的頻繁與便捷，世界經濟全球化的進程，人流，物流，信息流更加暢通，耐藥菌種的傳播速度越來越快，範圍越來越廣，所以，細菌耐藥性和耐藥性轉移已成為全球性的、世紀性的嚴肅命題，已引起各國政府和科學家的高度重視。
為了更好地發揮抗生素藥物的作用，對付細菌對抗菌藥物產生抗藥性，2014年6月前已有技術的方法是（1）加大抗生素藥物的用藥劑量；（2）交替使用抗生素藥物；（3）對有適應證的動物或病人，藥物種類、用量及使用時間都必須嚴格控制，能用窄譜的就不要用廣譜抗菌藥物，能用一種有效的就不必用多種，以避免耐藥性和二重感染；（4）嚴格掌握抗菌藥物的使用適應證，病毒感染不應採用抗菌藥物治療；（5）加快新型抗生素藥物的研製。
發明內容
專利目的
《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》的第一個目的是提供了一株嗜酸乳桿菌的新菌株（Lactobacillus acidophilus）XD13R，其保藏號為CCTCC NO：M 2014216，該菌株具有減少動物體內抗藥性細菌的比例的能力，可降低動物及人體對多種抗生素的抗藥性。
該發明的第二個目的是提供一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑，利用該生物製劑餵養畜禽動物可降低動物體內對不同抗生素抗藥性細菌比例30~96%。
該發明的第三個目的是提供一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R製備生物製劑的方法。
技術方案
《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》的第一個目的提供的嗜酸乳桿菌新菌株（Lactobacillus acidophilus）XD13R，它具有降低動物體內抗藥性細菌的比例的能力。該嗜酸乳桿菌新菌株XD13R已經於2014年5月22日在中國典型培養物保藏中心保藏，並收到保藏登記號CCTCC NO：M 2014216。
該發明第二個目的通過以下技術措施來實現：一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑，其由以下方法製備而成：
（1）配製培養基：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖2.0~5.0%、蛋白腖1.5~4%、酵母膏0.5~3%、KH2PO40.2~3%、西紅柿汁3~8%、水餘量；
（2）取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的所述步驟（1）製備的培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵3~15天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
該發明步驟（2）中的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R按照常規的從100升種子罐到1000升發酵罐的發酵工藝及接種量培養，就可以實現該發明的目的。但是作為該發明的一個實施例，優選的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液在種子罐的接種量在培養基總質量的5~10%範圍內。
所述步驟（2）中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液的製備方法：接種嗜酸乳桿菌XD13R的新鮮培養物至MRS培養基中，30-40攝氏度培養18~48小時即可。
該發明第三個目的通過以下技術措施來實現：一種用上述嗜酸乳桿菌製備生物製劑的方法，其包括以下步驟：
（1）培養基的製作：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖2.0~5.0%、蛋白腖1.5~4%、酵母膏0.5~3%、KH2PO40.2~3%、西紅柿汁3~8%、水餘量；
（2）取嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的所述步驟（1）製備的培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵3~15天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
所述步驟（2）中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液的製備方法：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的新鮮培養物至裝有MRS培養基的三角瓶中，在30-40攝氏度的培養箱中培養18~48小時，獲得XD13R菌液。
改善效果
《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》與2014年6月前已有技術相比具有以下優點：
1.該發明提供的嗜酸乳桿菌菌株（Lactobacillus acidophilus）XD13R，是非致病菌，是一種益生菌，該菌株具有減少動物體內抗藥性細菌的比例的能力，可降低動物及人體對多種抗生素的抗藥性。
2.該發明的嗜酸乳桿菌製備的生物製劑，利用該生物製劑餵養畜禽動物可降低動物體內對不同抗生素抗藥性細菌比例30~96%，將其套用於畜禽養殖中，可以降低養殖動物對2014年6月前常用的多種抗生素的抗藥性，降低常見疫病的治療難度。
附圖說明
圖1是《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》提供的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的DNA測序圖。
圖1
技術領域
《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》涉及了一株能降低動物抗藥性的嗜酸乳桿菌，尤其涉及一株能減少動物體內抗藥性細菌比例的嗜酸乳桿菌。該發明同時還涉及了使用該嗜酸乳桿菌新菌株製備的生物製劑及方法。
權利要求
1.一種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）新菌株XD13R，其保藏號為CCTCC M 2014216，其具有降低動物體內抗藥性細菌的比例的能力。
2.一種用權利要求1所述的嗜酸乳桿菌製備的生物製劑，其特徵在於，其由包括以下步驟的方法製備而成：
（1）配製培養基：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖2.0~5.0％、蛋白腖1.5~4％、酵母膏0.5~3％、KH2PO40.2~3％、西紅柿汁3~8％、水餘量；
（2）取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的所述步驟（1）製備的培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵3~15天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌製備的生物製劑。
3.根據權利要求2所述的嗜酸乳桿菌製備的生物製劑，其特徵在於，所述步驟（2）中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R按照常規的從100升種子罐到1000升發酵罐的發酵工藝及接種量進行培養，所述嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液在種子罐的接種量在培養基總質量的5~10％範圍內。
4.根據權利要求2所述的嗜酸乳桿菌製備的生物製劑，其特徵在於，所述步驟（2）中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液的製備方法：接種XD13R的新鮮培養物至MRS培養基中，30-40攝氏度培養18~48小時即可。
5.一種用權利要求1所述的嗜酸乳桿菌製備生物製劑的方法，其特徵在於，包括以下步驟：
（1）配製培養基：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖2.0~5.0％、蛋白腖1.5~4％、酵母膏0.5~3％、KH2PO40.2~3％、西紅柿汁3~8％、水餘量；
（2）取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的所述步驟（1）製備的培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵3~15天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌製備的生物製劑。
6.根據權利要求5所述的用權利要求1所述的嗜酸乳桿菌製備生物製劑的方法，其特徵在於，所述的步驟（2）中嗜酸乳桿菌XD13R菌液的接種量在培養基總質量的5~10％範圍內。
7.根據權利要求5所述的用權利要求1所述的嗜酸乳桿菌製備生物製劑的方法，其特徵在於，所述步驟（2）中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R菌液的製備方法：接種XD13R的新鮮培養物至MRS培養基中，30-40攝氏度培養18~48小時即可。
實施方式
實施案例
實施例一
嗜酸乳桿菌XD13R菌株的馴化和篩選：從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買了4株芽孢桿菌（XD05B-XD08B），3株乳酸菌（XD05R-XD07R），1株酵母（XD05J），從廣州百佳超市購買了2株酵母（XD06J-XD07J），再從自然界分離篩選了8株菌斑形態、菌體形態均有別於上述菌株的乳酸菌（XD08-RXD15R），合計共收集了4株芽孢桿菌（XD05B-XD08B），11株乳酸菌（XD05R-XD15R），3株酵母（XD05J-XD07J），然後將它們分別經10代高抗藥性細菌比例的生豬糞水環境的誘變培養，最後挑選出能適應上述生豬糞水環境的，能降低抗藥性細菌比例的菌株。
上述的高抗藥性細菌比例的生豬糞水：是從十多個養殖場取來新鮮豬糞各15公斤，按豬糞比水的重量比為1:5的比例配製後，濾去糞渣，將糞水分別添加0毫克/千克、25毫克/千克、50毫克/千克、100毫克/千克的鏈黴素和鹽酸林可黴素後，在35度培養箱培養36小時，分別進行細菌總數的計數，將各種抗生素分別添加25毫克/千克、50毫克/千克、100毫克/千克的細菌總數除以添加0毫克/千克的對照組的細菌總數，得出該糞水中的細菌在該抗生素該濃度下的抗藥性細菌比例，挑選出抗藥性細菌比例最高的糞水來自清遠市清城區沙田養豬場，作為該發明用於篩選具有降低抗藥性細菌比例功能的糞水。
上述的降低抗藥性細菌比例的檢驗方法：將上述方法製成的糞水分別裝入144個500毫升的三角瓶中，分別接種上述的18種菌，每種菌接種8瓶，在35度的培養箱培養8小時後，分別添加0毫克/千克、25毫克/千克、50毫克/千克、100毫克/千克的鏈黴素和鹽酸林可黴素，在35度培養箱培養36小時，分別進行細菌總數的計數，將各種抗生素分別添加25毫克/千克、50毫克/千克、100毫克/千克的細菌總數除以添加0毫克/千克的對照組的細菌總數，得出該糞水中的細菌在該抗生素該濃度下的抗藥性細菌比例，該發明首先篩選出具有降低糞水中抗藥性細菌比例的菌株，再經過上述步驟重複10次，最終篩選出降低抗藥性細菌能力最強的菌株為XD13R，對該菌株我們送華南農業大學分子遺傳實驗室進行DNA測序（見圖1），結果證明該菌株是一株嗜酸乳桿菌的菌株。
實施例二
（1）製備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的新鮮培養物至裝有MRS培養基的10~20個500毫升三角瓶中，在30攝氏度的培養箱中培養48小時，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液；
（2）培養基的製作：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖4%、蛋白腖2.5%、酵母膏1%、KH2PO41%、西紅柿汁4%、水餘量。
（3）取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的上述培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵15天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
實施例三
（1）製備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的新鮮培養物至裝有MRS培養基的10~20個500毫升三角瓶中，在38攝氏度的培養箱中培養40小時，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液；
（2）培養基的製作：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖4%、蛋白腖2.5%、酵母膏1%、KH2PO41%、西紅柿汁4%、水餘量。
（3）取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的上述培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵4天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
實施例四
（1）製備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的新鮮培養物至裝有MRS培養基的10~20個500毫升三角瓶中，在40攝氏度的培養箱中培養18小時，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液；
（2）培養基的製作：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖5%、蛋白腖2%、酵母膏1.5%、KH2PO41.2%、西紅柿汁6%、水餘量。
（3）取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經過高溫滅菌的上述培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵5天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
實施例五
（1）製備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XD13R的新鮮培養物至裝有MRS培養基的10~20個500毫升三角瓶中，在35攝氏度的培養箱中培養35小時，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液；
（2）培養基的製作：以蔗糖、蛋白腖、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配製培養基，它們的重量百分比為：蔗糖5.0%、蛋白腖4%、酵母膏3%、KH2PO43%、西紅柿汁8%、水餘量。
（3）取上述嗜酸乳桿菌菌液接種至經過高溫滅菌的上述培養基中，調整起始pH至5~6.5，在發酵罐中進行厭氧發酵10天，至終點pH為3~4，即得該嗜酸乳桿菌XD13R製備的生物製劑。
試驗案例
試驗例一
以將所篩選出來的嗜酸乳桿菌XD13R菌株製成的生物製劑在廣東省清遠市清城區沙田養豬場、廣東省鶴山市鶴城鎮鄧三輝養豬場，鶴山市源生態農民專業合作社馬山養殖場進行養殖了3個批次共90頭肉豬的養殖試驗，試驗的方法是選擇30公斤左右的普通瘦肉型中豬，將上述實施例三所製成的生物製劑按重量比1:50的比例稀釋後每天供生豬飲用，經60-90天的餵養試驗結果表明，這種生物製劑適口性好，生豬喜歡飲用，安全性好，沒有出現任何不良反應，吃了這種飼料的生豬極少發病，欄舍內的氨氣濃度一直保持在0-5百萬分比濃度之間，明顯優於國家行業標準（欄舍內氨氣濃度≤30百萬分比濃度），生豬糞便中的抗藥性細菌比例如表一所示：
抗生素種類 | 試驗組抗藥性細菌比例（%） | 對照組抗藥性細菌比例（%） | 試驗組的抗藥性細菌比對照組減少（%） |
|---|---|---|---|
青黴素（25毫克/升） | 0.76 | 1.56 | 51.28 |
鏈黴素（25毫克/升） | 1 | 25 | 96.00 |
慶大黴素（25毫克/升） | 0.0013 | 0.0079 | 83.54 |
鹽酸林可黴素（25毫克/升） | 6.67 | 20 | 66.65 |
試驗例二
將所篩選出來的嗜酸乳桿菌XD13R菌株製成的生物製劑在廣東省鶴山市桃源鎮麥明益養豬場、廣東省鶴山市雅瑤鎮李建芳養豬場，鶴山市源生態農民專業合作社馬山養殖場進行養殖了3個批次共90頭肉豬的養殖試驗，試驗的方法是選擇30公斤左右的普通瘦肉型中豬，將上述實施例三所製成的生物製劑按重量比1:300的比例添加到飼料中每天供生豬食用，經60-90天的餵養試驗結果表明，這種生物製劑適口性好，生豬喜歡用，安全性好，沒有出現任何不良反應，吃了這種飼料的生豬極少發病，欄舍內的氨氣濃度一直保持在0-4百萬分比濃度之間，明顯優於國家行業標準（欄舍內氨氣濃度≤30百萬分比濃度）。
試驗例三
將所篩選出來的嗜酸乳桿菌XD13R菌株製成的生物製劑在廣東省鶴山市古勞鎮馮景強、王耀文養殖場進行養殖了3個批次共90頭肉豬的養殖試驗，試驗方法是選擇30公斤左右的三元雜中豬，將述實施例二所製成的生物製劑直接投餵（即餵養100%的發酵飼料），經60-90天的餵養試驗結果，與上述試驗例一和二採用瘦肉豬養殖的差異不顯著。
試驗例四
將所篩選出來的嗜酸乳桿菌XD13R菌株製成的生物製劑在廣東省鶴山市古勞鎮馮景強、王耀文養殖場進行養殖了3個批次共90頭肉豬的養殖試驗，試驗方法是選擇30公斤左右的三元雜中豬，將實施例二所製成的生物製劑30%，添加60%左右的普通中豬飼料，經60-90天的餵養試驗結果，與上述試驗例一和二採用瘦肉豬養殖的差異不顯著。
專利榮譽
2021年6月24日，《一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其製備的生物製劑》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
