植物乳桿菌代謝低聚果糖轉錄調控機制的研究

《植物乳桿菌代謝低聚果糖轉錄調控機制的研究》是依託上海套用技術大學，由陳臣擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：植物乳桿菌代謝低聚果糖轉錄調控機制的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：陳臣
• 依託單位：上海套用技術大學

項目摘要

低聚果糖（FOS）對腸道中乳酸菌的選擇性增殖作用已被大量體內和體外研究證實，但是關於其代謝通路及調控機理的研究還處於起步階段。前期研究中，申請人採用系統生物學策略研究並發現了兩個基因簇參與到植物乳桿菌利用FOS的代謝過程。為了更深入了解植物乳桿菌代謝FOS的生理活動規律，本課題從基因轉錄調控的角度出發，首先分析兩個基因簇各自的轉錄單元和轉錄起始位點，測定靶基因在不同碳源培養下的表達情況；通過構建基因敲除和回補突變株研究各調控因子對靶基因的調控關係，採用親和力篩選策略鑑定轉錄因子與啟動子區相應位點的特異性結合。在上述基礎上，分析轉錄因子、結合位點與RNA聚合酶之間的相互作用，構建FOS代謝的局部轉錄調控網路，探討植物乳桿菌應對碳源變化的回響機制。通過本課題的實施揭示植物乳桿菌利用FOS的轉錄調控機制，為進一步通過體內實驗探索其在腸道內利用FOS的生理活動過程奠定基礎。

結題摘要

本項目針對目前對於乳酸菌代謝低聚果糖調控機理不明確等問題，以轉錄因子CcpA、SacR1和SacR2為主要研究對象，分析並驗證各調控因子對靶基因的調控關係。採用基於親和力篩選的生物學策略建立轉錄因子與靶基因啟動子區結合位點的相互作用；結合生物信息學和數學建模手段構建植物乳桿菌代謝FOS的全局調控網路，主要結論如下：（1）基因簇sacPTS1有兩個操縱子轉錄單元組成，其中，操縱子sacK和pts1為一個操縱子單元，操縱子sacA、sacR和agl2為一個操縱子單元；基因簇sacPTS2是一個完整的操縱子；利用生物信息學軟體在靶基因上發現了6個潛在的CcpA結合的cre位點，2個SacR1和1個SacR2潛在結合的位點。（2）構建了三個轉錄調控因子的異源表達載體。EMSA實驗證實了CcpA轉錄因子與cre位點的特異性結合，ChIP-qPCR實驗確定了CcpA對靶基因啟動子區DNA具有很高的富集度；SacR1和SacR2轉錄因子與靶基因啟動子區的特異性結合也通過EMSA實驗進行了證實。（3）利用Cre-loxP敲除系統分別構建了三個轉錄因子的敲除突變株。ccpA基因的缺失，導致植物乳桿菌在混合碳源下二次生長現象的消失。RNA-seq實驗表明7-15%的基因發生了差異化表達：參與碳水化合物代謝的基因主要發生了上調，而下調最為顯著的是參與脂肪酸合成的基因；通過調控方式的分析，發現 CcpA可以通過直接、間接和直接-間接相結合三種方式對靶基因進行調控。在ccpA基因敲除的基礎之上對sacR1和sacR2基因進行敲除，導致sacPTS1和sacPTS26基因簇上的基因完全去阻遏，所有受到抑制的基因得到釋放。（4）利用ChIP-seq實驗在植物乳桿菌中共捕獲到507個不同富集倍數peaks，鑑定出5個motif，在植物乳桿菌基因組上共尋找到159個調控基因。結合RNA-seq數據，共發現39個基因受CcpA的直接調控。以CcpA為中心，包括局部調控因子SacR1和SacR2在內構建了全局調控網路模型，證明了植物乳桿菌代謝低聚果糖受到全局調控和局部調控的雙重效應。綜上所述，本項目利用系統生物學策略揭示植物乳桿菌利用FOS的轉錄調控機制，為進一步通過體內實驗探索植物乳桿菌在腸道內利用FOS 的生理活動規律奠定基礎。