基本介紹
- 中文名：高壓液相色譜法
- 理論：氣相色譜
- 技術：高壓輸送
- 特點：高壓、高速、高效
特點,分離原理,系統結構,
特點
2.高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於1h。
3.高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
5.適應範圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於套用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於400以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的75%～80%）原則上都可套用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重複性好，且須在色譜儀中進行。
分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。
a.正相液—液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小於固定液的極性。
2．液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如矽膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm+nSa======Xa+NSM
式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
3．離子交換色譜法(Ion-exchangeChromatography)
以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-(溶劑中)+(樹脂-R4N+Cl-)===(樹脂-R4N+X-)+Cl-(溶劑中)
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
分配係數為：
DX=[-R4N+X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關係]
凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
4．離子對色譜法(IonPairChromatography)
X+水相+Y-水相===X+Y-有機相
式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。
當達平衡時：
KXY=[X+Y-]有機相/[X+]水相[Y-]水相
根據定義，分配係數為：
DX=[X+Y-]有機相/[X+]水相=KXY[Y-]水相
[討論：DX與保留值的關係]
5．離子色譜法(IonChromatography)
抑制柱上發生的反應：
R-H++Na+OH-===R-Na++H2O
R-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-
離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6．空間排阻色譜法(StericExclusionChromatography)
空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
系統結構
1．進樣系統
2．輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3.分離系統
該系統包括色譜柱、連線管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連線管），內徑為2～5mm，由"優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成，它們都有惰性（如矽膠表面的矽酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的製備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性矽膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜頻寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
4．檢測系統
（1）紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、胺基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g/ml）；線性範圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
（3）螢光檢測器
凡具有螢光的物質，在一定條件下，其發射光的螢光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有螢光的有機化合物（如多環芳烴、胺基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、製備或鑑定工作能正確開展。
操作注意要點：
1)．首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2)．對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)．正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然後再進入測試用流動相(如流動相為緩衝試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機相衝淨為止)。
4)．一般情況下，流動相衝洗20-30分鐘後，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走後，方可進樣測試。
5)．同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間後，就可以正式進行樣品的測試了。
6)．樣品測試結束後，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩衝試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7)．關機時，先關計算機，再關液相色譜。
8)．填寫登記本，由負責人簽字。
操作注意要點：
1)．首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2)．對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)．正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然後再進入測試用流動相(如流動相為緩衝試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機相衝淨為止)。
4)．一般情況下，流動相衝洗20-30分鐘後，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走後，方可進樣測試。
5)．同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間後，就可以正式進行樣品的測試了。
6)．樣品測試結束後，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩衝試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7)．關機時，先關計算機，再關液相色譜。
8)．填寫登記本，由負責人簽字。
