凝膠色譜:分類,分離原理,凝膠種類,填料合成,實驗技術,研究動向,參考文獻,

凝膠色譜技術是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用於高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛採用，不但套用於科學實驗研究，而且已經大規模地用於工業生產。

基本介紹

中文名：凝膠色譜
外文名：Gel chromatography
別稱：分子排阻色譜法
出現時間：六十年代初

分類,分離原理,凝膠種類,填料合成,實驗技術,研究動向,參考文獻,

分類

根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠過濾色譜

凝膠過濾色譜一般用於分離水溶性的大分子，

如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜法主要用於有機溶劑中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。

凝膠色譜不但可以用於分離測定高聚物的相對分子質量和相對分子質量分布，同時根據所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質，分離相對分子質量的範圍從幾百萬到100以下。

凝膠色譜也廣泛用於分離小分子化合物。化學結構不同但相對分子質量相近的物質，不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目的。

分離原理

一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由於直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落後於大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的後流出，分子最小的最後流出，這種現象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。

各種分子篩的孔隙大小分布有一定範圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用範圍。

一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離範圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對於分子大小不同，但同屬於凝膠分離範圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。於是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的後通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小排隊，凝膠表現分子篩效應。

凝膠種類

聚丙烯醯胺凝膠

聚丙烯醯胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯醯胺為單位，由甲叉雙丙烯醯胺交聯成的，經乾燥粉碎或加工成形製成粒狀，控制交聯劑的用量可製成各種型號的凝膠。交聯劑越多，孔隙越小。聚丙烯醯胺凝膠的商品為生物膠－P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。即丙烯醯胺和少量交聯劑甲叉雙丙烯醯胺，在催化劑過硫酸銨作用下聚合形成凝膠。

聚丙烯醯胺簡稱PAM，分子量100～500萬。聚丙烯醯胺主要有兩種商品形式，一種是粉末狀的，另一種是膠體，還有聚丙烯醯胺乳液 (上海合成樹脂研究所研製) 。易溶於冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯醯胺當濃度超過10%以後．就會形成凝膠狀結構。提高溫度可以稍微促進溶解，但溫度不得超過50℃，以防發生分子降解。難溶於有機溶劑。溫度超過120 ℃時分解。中性，無毒。用作增稠劑、絮凝劑、減阻劑，具有凝膠、沉降、補強等作用。貯存於陰涼、通風、乾燥的庫房內，防潮、避光、防熱。存放時間不宜過長。

交聯葡聚糖凝膠（Sephadex）　

⑴ Sephadex G交聯葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G後面的阿拉伯數為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝膠的交聯程度，膨脹程度及分部範圍。

⑵ Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶於水及親脂溶劑，用於分離不溶於水的物質。

瓊脂糖凝膠　

瓊脂糖Agarose，縮寫為 AG，是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份，也譯為瓊膠素或瓊膠糖。瓊膠糖化學結構由β-D-吡喃半乳糖 (1-4) 連線3,6-脫水α-L-吡喃半乳糖基單位構成。

把瓊脂糖，即幾乎不含硫酸根的主要成分為多糖的瓊脂，溶於熱水，冷卻製成的凝膠。製成的小顆粒用於凝膠過濾。適於用sephadex不能分級分離的大分子的凝膠過濾，若使用5%以下濃度的凝膠，也能夠分級分離細胞顆粒、病毒等。利用其吸附性小的特點，有時用它代替瓊脂、以作為免疫電泳或凝膠內沉降反應的支持物。

瓊脂糖凝膠商品名很多，常見的有，

Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國，Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網狀結構，網狀結構的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結構是穩定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9範圍內的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。聚苯乙烯凝膠　

商品為Styrogel，具有大網孔結構，可用於分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用於有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞碸。

填料合成

凝膠色譜填料合成技術的進展主要在下面四個方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔矽微球的合成成功、小孔徑多孔矽微球合成成功以及新的矽微球表面化學改性的發展。在這方面有較多的新產品，中國也有許多單位在研製和生產。高效凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的套用面。

四種多孔矽膠的理論塔板數　

高效色譜柱除了對填料的粒度有要求外，對粒度分布也要求相當窄。用一般的製備方法往往得到粒度較寬的產品，需要進一步過篩。當填料的粒度在30微米以下時，這種過篩非常困難，已經成為填料製備上一個較大的技術難關。Kirkland，利用了尿素和甲醛在酸性介質中形成大小均勻的液體高聚物，加入某種矽溶膠時，矽溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。最後把有機高聚物灼燒掉後就能得到由微粒矽珠堆積而成的多孔填料。這種堆積矽珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔徑決定於原始矽溶膠的規格，用不同的矽膠就可以製得不同孔徑的填料。柴志寬等則利用一種矽膠製成粒度分布窄的填料後，再利用適當的擴孔方法以得到各種孔徑的填料。從這些方法製得的微球填料，粒度分布可以達到相當窄，所以可以不經篩選直接使用。

用 GPC和GPC-LALLS得到PS標樣分子量比較　

隨著進樣技術和色譜柱接頭設計的改進，已經可以得到柱效每米在八萬到十萬的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球矽膠裝填色譜柱，都能達到每米八萬到十萬塊塔板數的高效。他用這種色譜柱有效地進行了案件偵查中所要求的分析問題。

實驗技術

層析柱

層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般製備用凝膠柱，直徑大於2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布於凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決於柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由於軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5：1─10：1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20：1─100：1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應儘可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。

凝膠的選擇　

根據所需凝膠體積，估計所需乾膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水後的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1 克Sephadex G─200吸水後形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質採用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好，脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

凝膠的製備　

商品凝膠是乾燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內即可完成。特別是在使用軟膠時，自然膨脹需24小時至數天，而用加熱法在幾小時內就可完成。這種方法不但節約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內的空氣。

樣品溶液的處理　

樣品溶液如有沉澱應過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30%。分級分離樣品體積要小，使樣品層儘可能窄，洗脫出的峰形較好。

防止微生物的污染　

交聯葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有：

⑴疊氨鈉（NaN3）

在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶於水，在20℃時約為40%；它不與蛋白質或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾螢光標記蛋白質。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強鹼性溶液中或溫度高於60℃時易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉

在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質結合，因而包含疏基的蛋白質可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽

在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微鹼性溶液中抑效果最佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產生沉澱；還原劑可引起此化合物分解；含巰基的物質亦可降低或抑制它的抑菌作用。

研究動向

凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面的，其中儀器、填料、聯用技術、色譜理論等方面的進展是和整個液體色譜的進展相關的。但是下面四個研究動向意義較大，值得注意。

通過與其他儀器聯用，解決凝膠色譜法測定高聚物分子量分布從相對法向絕對法過渡。測定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的套用。試樣先根據分子體積(即分子量)分離後再檢測各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中進行的，被分離後的組分在流出柱子時就同時連續地用濃度檢測器和分子量檢測器分別檢側各組分的濃度和分子量，把兩個檢測器的輸出訊號用記錄儀記錄後即得反映分子量分布的凝膠色譜曲線。過去由於沒有比較靈敏和瞬時回響的分子量檢測器，因而利用一組不同分子量的標樣來標定色譜柱，然後從分子量淋出休積的標定曲線來作數據換算。這種用相對方法來檢測分子量雖然暫時解決了問題，但是隨之而來的是實驗工作量增加以及數據處理方法上存在困難。實驗數據的可靠性在很大程度上決定於標定曲線、標樣分子量數值以及數據處理方法的可靠性。其中色譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應的改正，不但實驗方法比較煩瑣，而且數據處理也比較複雜，需要用電子計算機來計算。所以雖然文獻中已經推薦許多據說是比較滿意的計算方法，但這總不是一個根本解決的方法。只有真正找到絕對分子量檢測器，問題才算較好解決。原有的許多分子量測定方法，由於不能做到足夠靈敏的瞬時回響而未能成功地在凝膠色譜上套用。

Ouano用雷射小角光散射儀(LALLS)來作分子量檢測器得到比較好的結果。實驗數據不需要標定曲線，也不必進行峰加寬改正。

由於雷射的準直性較好，強度較大，可以允許在較小的角度下測量較稀溶液的散射光強，由此可以直接計算出重均分子量的近似值而不需要象經典光散射那樣實驗數據還要對濃度和散射角度向零作雙外推。實驗上，凝膠色譜儀和雷射小角光散射儀聯用後，還可與計算機直接聯接進行數據處理。在一次實驗進行完畢後，所需要的數據可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的數值。雷射小角散射儀已開始商品化，預計不久將會有更多的研究工作，來說明已經在何種程度上解決了凝膠色譜的相對測定過渡到絕對測定。凝膠色譜中的濃度檢測器和通常的液體色譜一樣仍然是一個薄弱環節，繼續在尋找更理想的檢測器。目前最常用的仍然是示差折光檢測器和紫外檢測器。

Hoffmann和Urban用自動濁度滴定裝置來作濃度檢測器也收到一定效果，特別對二元共聚中測定分子量分布和組成分布，效果比較顯著。Jorgenson等用光散射法側定淋出溶質的沉澱，也證明是一個較靈敏的方法。Francois等用密度計來檢側濃度，提供了另一條通用性檢測器的途徑。其他如質譜和原子吸收光譜也都能與凝膠色譜聯用。隨著套用的擴大，凝膠色譜可以用於測定高聚物長支鏈的支化度。

高效凝膠色譜

在整個液體色譜領域裡，高效液體色譜取代經典的液體色譜的趨勢是非常迅速的。這是由於色譜理論、填料製備技術和儀器合理設計三方面聯合發展的必然結果。凝膠色譜向高效階段發展就其本身來說，又是一次意義較大的進展，因為凝膠色譜雖然具有許多優點，但是它一直被認為是一種分離效率比較低、色譜柱的峰容量小和速度慢的技術。在廣泛的非高分子化合物領域中沒有得到應有的使用。

在經典的凝膠色譜中，填料的粒度一般用37-75 μ。色譜柱長12尺以上，柱徑7.8毫米，流速通常用1毫升/分。在這些條件下，一次實驗時間往往需要三小時。加快流速會降低分離效率，因為凝膠色譜是一個由擴散控制的分離過程，高分子在溶液中擴散較慢，這就必然使流速受到一定限制。凝膠色譜峰容量較小的原因是和體積排除的分離機理有關。這些缺陷的克服都有待於填料柱效的大幅度提高。高效凝膠色譜填料的合成成功以及高效裝柱技術的發展，實現了柱效的提高，從而實現了實驗時間縮短，峰寬變窄和峰容量增加。

現在粒度為10 μ的填料可以使分子量分布測定時間從三小時縮短到十幾分鐘，這個時間甚至比高分子在溶劑中溶解所需的時間還短。在工業上已有人用凝膠色譜圖來作為訂購驗收指定分子量分布的高聚物產品。由於不需要費太多時間來做條件試驗，凝膠色譜在一般化合物領域裡套用時的方便程度已可以和其他類型高效液體色譜相競爭。

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