排阻色譜技術

排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）是一種根據試樣分子的尺寸進行分離的色譜技術。又稱為凝膠色譜法、分子排阻色譜法、尺寸排阻色譜法等，是液相色譜的一種。

基本介紹

• 中文名：排阻色譜法
• 外文名：size exclusion chromatography
• 性質：物理化學分析方法

分離原理

排阻色譜法（SEC）亦稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法。是一種根據試樣分子的尺寸進行分離的色譜技術。

排阻色譜的分離機理是立體排阻，樣品組分與固定相之間不存在相互作用的現象。色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網狀物質。凝膠的孔穴大小與被分離的試樣大小相當。僅允許直徑小於孔開度的組分分子進入，這些孔對於流動相分子來說是相當大的，以致流動相分子可以自由地擴散出人。對不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內的不同深度，大個的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內，但進不了小孔，甚至於完全被排斥。小個的組分分子，大孔小孔都可以滲進去，甚至進入很深，一時不易洗脫出來。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時間較短，很快被洗出，它的洗脫體積（即保留時間）很小。小的組分分子在色譜柱中停留時間較長，洗脫體積卿保留時間）較大，直到所有孔內的最小分子到達柱出口，這種按分子大小而分離的洗脫過程才告完成。

因為分子尺寸一般隨分子量的增加而增大，所以根據分子量表達分子尺寸比較方便。將因分子過大而不能部分地進入某一給走固定相孔內的最小的樣品粒子的分子量，定義為該固定相的排阻極限。

可以預料，相對分子質量介於上述兩個極限之間的化合物，將根據它們的分子尺寸，進入一部分孔隙，而不能進入另一部分孔隙，其結果使這些化合物按相對分子質量降低的次序被洗脫。所以，在選擇固定相時，應使欲分離樣品粒子的相對分子質量落在固定相的滲透極限和排阻極限之間。由色譜過程的基本方程式可得：
VR=V0+KsecVi
式中VR為保留體積（溶質洗脫體積），Vt為凝膠顆粒之間的體積（也稱為間隙體積）；Vi為凝膠內孔體積，也即溶質分子能夠滲透過去的那部分體積（也稱為總孔容積）；Ksec為排阻色譜的分配係數。
所以，Ksec被定義為溶質分子滲入內孔體積的分數，其數值在0～1之間，其值取決於組分分子的大小。對於完全不能進入凝膠孔內的大分子（即大於排阻極限的物質），其分配係數為零，即Ksec一Cs/Cm=O，則VR=V0；對於能自由出入凝膠孔的小分子，其在固定相內部的濃度與在固定相外部的濃度相同，則Ksec=1，即VR=V0+Vi因此所有組分只能在V0和V0+Vi的洗脫體積之間被依次洗脫下來，不會超越這個界限。
同時還可以看出，柱子的間隙體積V0可通過測量相對分子質量大於固定相排阻極限的物質的保留體積而決定；對於已知V0的柱子，其固定相體積（總孔容積）可通過測量相對分子質量小於固定相滲透極限的物質的保留體積而決定。因為該物質Ksec為l，VR和V0已知，所以利用式VR=V0+KsecV可計算Vi。能夠部分進入固定相孔內的物質其分配係數一定在0與1之間，可通過把物質的Vi，V0和保留體積代人式VR=V0+KsecV而求出。

排阻色譜法中，保留時間是分子尺寸的函式，因此有可能提供分子結構的某些信息。它主要用來獲得分散性聚合物的相對分子質量分布情況。但它不能分辨分子大小相近的化合物。一般說來，分子量的差別需在10%以上時才能得到分離，所以該法不能用於分離複雜的混合物。

特點

1.保留時間是分子尺寸的函式，有可能提供分子結構的某些信息。

2.保留時間短，譜峰窄，易檢測，可採用靈敏度較低的檢測器。

3.固定相與分子間作用力極弱，趨於零。由於 ,柱子不能很強保留分子因此柱壽命長。

4.不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必須大於10%能得以分離。

5.大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，後流出色柱；而中等分子居兩者之間。

6.生物相容性好，有很高的活性回收率。

類型

凝膠過濾色譜：用於分析多肽、蛋白質、核酸、多糖等。凝膠的代表是葡萄糖系列；流動相是水

凝膠滲透色譜法：用於分析高聚物的摩爾質量，如：聚乙烯、聚氯乙烯等。

常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠；流動相是有機溶劑（四氫呋喃）

填料和流動相

排阻色譜分離的基礎是不同分子大小的組分進人填料內孔深度的不同。因此，選擇和搭配具有不同孔徑，色譜性能良好的填料是很重要的，填料孔徑大小應與試樣分子量的大小相適應。

填料

根據填料的化學性質不同，可分為有機和無機填料兩大類。前者如交聯聚苯乙烯凝膠，後者如多孔矽膠和多孔玻璃等。交聯聚苯乙烯凝膠是目前使用最多的一種填料，用它裝填的色譜柱滲透性好，柱效高，但不宜長期在高溫條件下使用。矽膠、多孔玻璃等無機填料，耐高溫、機械性能穩定，但它們的共同缺點是其表面的吸附物性，由於表面的剩餘羥基產生的活性中心，對一些極性物質有吸附作用，因而擾亂了排阻色譜分離的機理，這就要求完全的化學矽烷化處理，以消除表面殘留羥基的影響。

按填料機械強度可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。

軟性凝膠：如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯結構，其微孔能吸入大量的溶劑，並能溶脹到它們乾體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用於小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中

半剛性凝膠：如高交聯度的聚苯乙烯 （Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用於高效液 相色譜時，流速不宜大。

剛性凝膠：如多孔矽膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑 又可用有機溶劑作流動相 ，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小於7MPa，流速<1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。

流動相

在排阻色譜中使用的流動相，僅僅作為試樣的載體而不應與試樣本身或填料有任何的相互作用，即不存在吸附或分配作用，以免出現假性分子量的保留值。此外，還要求能完全溶解試樣，在分離溫下粘度低，其沸點通常不柱溫高20～50℃，與檢測器匹配等。溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。常用的流動相有：四氫呋喃、十氫化萘、氯仿、二甲基甲醯胺等。

套用

排阻色譜主要被用與分離大分子物質，其分離範圍從相對分子質量2000～2000000之間，這些物質大多是生物化學物質和聚合物等。此外，排阻色譜越來越多的套用是通過測量相對分子質量分布來鑑定高聚物及研究高聚物聚合機理、聚合工藝、條件等。