體積排除色譜

體積排除色譜(size exclusion chromatography，SEC)，是色譜個分離模式中最簡單、最單純的一種類型。在排除色譜中，溶質即待測樣品組分，與固定相或填料、流動相之間沒有額外的相互作用。只依據分子的體積(流動力學體積)的大小而分離。

作為液相色譜技術的一個重要分支，SEC方法最廣泛的用途是測定合成聚合物的分子量分布；對於某些大分子樣品如蛋白質、核酸等，也是一種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡便快速地分離那些樣品組分中分子量相差較大的簡單混合物。它非常適合於未知樣品的初步探索分離，無需進行複雜實驗就能獲得樣品組成分布方面較為全面的概況。

基本介紹

• 中文名：體積排除色譜
• 外文名：Size exclusion chromatography
• 簡稱：SEC
• 適用：聚合物、某些大分子
• 優點：快速，無需梯度洗脫等
• 缺點：解析度和柱容量低

定義

體積排除色譜(size exclusion chromatography，SEC)方法，通常是一種對於分子量大於2000的物質按其分子尺寸大小進行分離的技術。作為液相色譜技術的一個重要分支，SEC方法最廣泛的用途是測定合成聚合物的分子量分布；對於某些大分子樣品如蛋白質、核酸等，也是一種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡便快速地分離那些樣品組分中分子量相差較大的簡單混合物。它非常適合於未知樣品的初步探索分離，無需進行複雜實驗就能獲得樣品組成分布方面較為全面的概況。

SEC方法按其淋洗體系通常分為兩大類，即水相SEC(也稱凝膠過濾色譜)和有機相SEC(也稱凝膠滲透色譜)。兩種方法的分離原理雖然是相同的，但柱填料及其分離對象和使用技術完全不同。

發展歷史

在文獻上，體積排除色譜的名稱曾很混亂，這是由於其發展歷史及所用分離材料的不同等因素所造成的。

1953年，Porath和Flodin首先用交聯葡聚糖凝膠在水溶液中分離水溶性高分子。這種交聯葡聚糖凝膠的商品名稱，即是後來廣為人們所知的Sephadex。由於其突出的優點，立即得到了生化界的承認和廣泛的套用。這種分離技術被稱為凝膠過濾(gel filltration chromatogr.)。

在水溶液體系中的成功，促使人們去研究非水有機溶劑體系中的凝膠色譜。1964年，Moore以苯乙烯一二乙烯苯共聚物為基質的不同孔徑的有機高分子凝膠，解決了分子量幾千至幾百萬的合成高分子的體積排除色譜分離問題。在分離高分子分級與分子量測定領域內，被稱之為凝膠滲透色譜(gel permeation chromatogr．)。1965年Waters公司的專用凝膠色譜儀問世(GPC 200)。以後的幾年中，從理論到儀器乃至套用等各個方面，凝膠色譜得到了快速發展並日臻完善，成為高效液相色譜家族中重要的一員。

關於名稱，20世紀70年代時曾統一為凝膠色譜(gel chromatography)。但是，體積排阻色譜這一名稱似乎能更確切地反映其分離過程的本質。因此，目前以稱其為體積排阻色譜為宜。不過，SEC主要的套用領域是生化分離和高分子科學，前者仍習慣地將其稱之為凝膠過濾色譜，而後者，更習慣地沿用凝膠滲透色譜的名稱。

優點

與其他幾種色譜分離模式相比，體積排阻色譜具有幾個突出的優點：

(1)出峰迅速，任何組分的保留體積均在K和%之間；

(2)溶質與固定相(填料)和流動相無相互作用，毋需梯度淋洗；

(3)分離時不會滯留雜質或殘留物在柱上，故柱壽命長；

(4)對於大分子，可以測定分子量及分子量分布；

(5)對於生物大分子，有很高的活性回收率；

(6)柱負載較大，利於製備分離。

缺點

作為一種分離方法，它也有本身難以克服的缺點。即，與其他色譜模式相比，體積排除色譜的解析度及峰容量均相對較低。

分離機理

體積排除色譜的分離，是在裝填有多孔性材料的色譜柱中進行的。多孔材料的孔有大有小。孔徑，有其“孔徑分布”。當流動相攜帶分子量不同的溶質進入色譜柱後，溶質會因濃度差而滲入或擴散進入填料的孔中。也就是說，溶質在兩相中的運動的動力是濃度梯度。但是，分子體積的大小，造成了在孔中擴散路徑的差異。形象地說，填料顆粒上的孔有大有小，但對於溶劑分子來說，它們是足夠大的，可以允許它們自由地擴散、進出。不過，對於體積大的分子來說，它們只能進入尺寸大於該分子的孔，對於比顆粒上的孔還要大的分子，它只能從孔旁流過。換句話說，分子量或分子尺寸較小的溶質，能占有更多的孔體積。這樣，分子體積不同的混合物一齊進入柱端時，經過淋洗、擴散，總是體積大的分子先流出柱子，分子量小的(即體積小)分子滯後流出。

填料與色譜指標

在SEC方法中，柱填料的性質必須與溶質和淋洗體系相匹配。欲分離的高分子樣品可能是油溶性的，也可能是水溶性的，前者只能在有機相體系中分離，後者只能在水相體系中分離，填料必須能被淋洗劑所浸潤。SEC方法要求填料與試樣儘可能不發生任何基團之間的相互作用，即在色譜過程中應儘可能避免非空間排除效應(如吸附、離子交換、分配等相互作用)的影響，而是完全按照分子尺寸大小進行分離。填料的多孔結構是SEC方法賴以建立的基礎。有關填料的孔結構參數(如孔度、孔徑、孔徑分布以及孔結構形態等)對於SEC技術來說尤為重要。

一種高效的SEC填料，它的化學結構應當能夠很好地適應欲分離對象和淋洗體系，並能有效地避免非空間排除現象的發生；它的物理結構除了具備均勻而合適的顆粒度外，還需要有光潔的表面(包括孔壁表面)、規整而通暢的孔結構形態、較大的孑L度以及適當的孔徑大小與分布。

SEC填料的色譜表征，除了前面所述的柱效、選擇性、分離度、穿透性等參數以外，還需滿足如下三項色譜指標要求。

排除極限

表示填料可以用來分離高分子物質的最大限度、超過這個限度溶質就會在填料的粒隙間穿過而沒有分離效果。排除極限主要取決於填料最大的有效孔徑。

分離範圍

表示填料可以分離高分子物質的分子量範圍。它一般指分離柱的分子量一淋洗體積校正曲線的線性部分。分子量高於和低於這個範圍的溶質分別被排除和滲透，均沒有分離效果。分離範圍主要取決於填料有效孔的分布範圍。對於高分子類型SEC填料，分離範圍通常以相差2個數量級的分子量為宜。

固流相比

指填料的有效孑L內體積與填料的顆料間隙體積之比值。它反映了色譜柱的分離容量，其值越大越好。在緊密填充的條件下，固流相比主要與填料的孔度有關。

以上所述，既是填料在製備過程中的主要研究內容，也是填料在套用過程中的重要參考依據。