高壓液相色譜又稱“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高壓液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術套用。
基本介紹
- 中文名：高壓液相色譜分析
- 外文名：High pressure liquid chromatography analysis
- 別名：高速液相色譜
- 技術類型：分離分析技術
- 流動相：液體
- 特點：高效、高靈敏度
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高壓液相色譜特點
高壓
高速
流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於1h。
高效
近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
高靈敏度
適應範圍寬
氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於套用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於400以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的75%～80%）原則上都可套用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型
液—液分配色譜法及化學鍵合相色譜
流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。
a.正相液—液分配色譜法:流動相的極性小於固定液的極性。
b.反相液—液分配色譜法:流動相的極性大於固定液的極性。
液—液分配色譜法的缺點：儘管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械衝擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點，套用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如矽膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm+nSa======Xa+nSm
式中：Xm--流動相中的溶質分子；
Sa--固定相中的溶劑分子；
Xa--固定相中的溶質分子；
Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-(溶劑中)+(樹脂-R4N+Cl-)===(樹脂-R4N+X-)+Cl-(溶劑中)
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
分配係數為：
DX=[-R4N+X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關係]
凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
離子對色譜法是將一種(或多種)與溶質分子電荷相反的離子(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：
X+水相+Y-水相===X+Y-有機相
式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；
Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；
X+Y---形成的離子對化合物。
當達平衡時：
KXY=[X+Y-]有機相/[X+]水相[Y-]水相
根據定義，分配係數為：
DX=[X+Y-]有機相/[X+]水相=KXY[Y-]水相
[討論：DX與保留值的關係]
離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及藥物等分離。
離子色譜法
用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設定了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。
以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：
抑制柱上發生的反應：
R-H++Na+OH-===R-Na++H2O
R-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-
可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。
離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
