基本介紹
- 中文名：變性高效液相色譜
- 外文名：denaturing high performance liquid chromatography
- 英文縮寫：DHPLC
- 說明：雜合雙鏈突變檢測技術
基本原理,技術發展,優勢,套用,
基本原理
將工作溫度 (柱溫 )升高使DNA片段開始變性，部分變性的DNA可被較低濃度的乙腈洗脫下來。由於異源雙鏈 (錯配的 ) DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特徵不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性，被色譜柱保留時間短於同源雙鏈，故先被洗脫下來，從而在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線。
技術發展
這一技術最先由Oefner於 1 995年建立，目前全球使用最多也最易操作的是美國transgenomic公司開發的WAVE 核苷酸片段分析系統，它通過一個獨特的DNA色譜柱—DNA Sep柱進行核酸片段的分離和分析。
優勢
作為近年來才建立並迅速發展的一種新型基因突變篩查技術，它既能夠自動化、高通量進行，且除PCR之外，勿需進行PCR引物修飾、購買特殊試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。而目前已有的許多DNA突變分析技術諸如單鏈構象多態性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP) 、變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能滿足此要求。DHPLC具有高通量檢測、自動化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動範圍廣、相對價廉等優點。與傳統的SSCP 、DGGE等方法相比，DHPLC有較多的優點。SSCP的結果受血樣質量、提取方法等因素的影響，並且需要跑膠、電泳；DGGE則需要標記引物，存在放射性污染，這兩種方法都比較費時費力。而DHPLC則高度自動化，可以自動取樣，檢測每個樣品只需要8分鐘左右。DHPLC與其他檢測DNA突變方法的最大不同在於，它能夠純化DNA片斷。當然，只能檢測雜合突變是DHPLC的不足之處，但是這可以利用混合的方法（即將純合突變樣品和野生型樣品混合）來解決。
方法學比較研究表明，DHPLC敏感性和特異性可達 96%～100 %，明顯高於常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等變異檢測技術。目前只有基於毛細管電泳技術發展起來的螢光單鏈構像多態性分析(F-SSCP)在敏感性和特異性方面能與DHPLC相媲美。但PCR引物的設計、PCR方法及條件、醫學教|育網|收集整理分離溫度及分離梯度等關鍵因素也影響DHPLC檢測敏感性。
總體說來，具備以下幾大優勢：
1.檢測的準確性高，對未知突變大於96%，已知突變大於99%。
2.檢測靈敏度高，能檢測低水平的突變，可靠檢測樣品中少至5%的基因型。
3.可分析異質性樣本，可進行混合樣品的分離檢測。
4.操作容易，自動化分析。
5.結果重複性高，速度快。
6.樣品通量高。
7.消耗品低價性，性價比高。
套用
目前，該技術在基因突變檢測、DNA微衛星鑑定、腫瘤雜合性缺失的檢測、RT-PCR的競爭性定量、基因作圖、細菌鑑定、DNA片段大小測定及寡核苷酸的分析和純化等許多基因組研究領域中套用廣泛，最近已被進一步套用到mRNA的檢測，鑑定差異表達的基因。
微生物領域
傳統的微生物分析技術主要通過瓊脂培養方法對細菌進行計數和鑑定，尤其是對複雜的混合菌群的分析更是如此。這些方法的缺點除了耗時外（12-72小時），許多細菌還需要特殊的培養條件，如需要苛刻培養條件或厭氧條件培養等，據估計，某些樣本菌群中（比如環境樣本）只有不到10%的細菌能培養成功。由於傳統方法的局限性，微生物學家正致力於通過分子遺傳方法對不同微生物樣本進行鑑定和分析。WAVE微生物分析系統是進行微生物分子分析的理想工具，它不僅可用於細菌的識別鑑定和檢測抗藥基因突變，還可用於真菌，病毒和寄生蟲等研究領域。
WAVE微生物分析系統是培養不依賴的混合微生物樣本分析平台，不僅能鑑定常見的微生物，還能鑑定不常見的，苛刻的，和厭氧的細菌。該技術簡單、快速、重複性好，樣品分析當天就能出結果。系統自動收集各個分離的DNA片段，並自動記錄分析數據。自動的片段收集功能為測序提供模板以進一步確認各種微生物。一旦特定樣本中各種微生物的峰型得到鑑定，那么樣本的峰型譜可用於定性和定量監測樣本中各種微生物的動態變化。
在微生物耐藥檢測中的套用
隨著耐藥性微生物的大量出現，針對傳染性病原體的治療策略制定和藥物研發變得越來越難。抗微生物治療面臨挑戰的一個重要原因就是缺乏能夠準確識別致病微生物和耐藥基因的有效臨床手段。近來發展起來的能識別病原體和研究微生物抗藥性的分子生物學方法又為抗微生物治療和藥物研發建立了希望。DHPLC技術可以準確地檢測耐藥性相關基因突變，已廣泛套用於微生物耐藥基因突變檢測，是基礎研究和臨床快速檢測已知和未知致病細菌以及細菌耐藥性基因突變的可靠技術。
從異源混合物中檢測遺傳突變基因對於監測感染過程中病原微生物耐藥性的變化至關重要。在沒有選擇壓力的情況下，耐藥突變基因的出現頻率低於野生型基因。而低頻率的突變很難通過測序檢測到，通過亞克隆後的測序結果會偏向頻率高的突變類型。DHPLC技術能提高檢測少數耐藥突變的能力，進而促進對耐藥病菌引起的傳染病的治療。
在微生物基因分型和鑑定中的套用
許多病菌具有不同的基因型，它們的致病性差異很大，但是它們其它的特性以及遺傳基因都非常相似，使得細菌的準確分型面臨很大的技術挑戰。在一場大範圍疫情爆發中，從菌株水平確定病原菌是至關重要的，只有了解了致病菌株才能正確選擇抗菌藥物，追蹤病菌的來源等。DHPLC通過對具有細微差異的DNA序列的分析可以從菌株水平識別病原菌。
從臨床治療的角度來看，準確確定致病微生物的種類具有重要的價值，它可以保證用藥的有效性。DHPLC技術能有效的識別病原微生物。利用通用PCR引物從多種細菌的16S核糖體RNA基因中擴增含有高度變異序列的片段。將這些來自不同種類細菌的擴增產物與參照菌株的擴增產物混和後進行DHPLC檢測，會產生一個獨特的色譜峰圖，可以作為鑑定細菌種類的分子指紋。
對混合微生物樣品的分離鑑定
在日常的微生物的檢測和鑑定工作中，常常是對混合樣品中的微生物進行鑑定。比如常見的污染食物的微生物有十幾種，對於一個污染的食物樣本，我們需要對所有可能污染的病菌進行鑑定，因而需要一種簡單，快速，靈敏的檢測技術。DHPLC技術在這方面顯示了其良好的套用價值。利用DHPLC靈敏檢測DNA序列差異的特性結合細菌16s rDNA基因分型的原理，在屬和種的水平上進行細菌鑑定，在部分難以鑑定的菌種間，輔以其它細菌DNA靶點進行進一步的分析，不同的細菌顯示特異的DHPLC峰型，從而得到分離和鑑定。
檢測微生物的廣泛套用
1． DHPLC技術可以可靠地從種屬和菌株水平識別微生物，彌補傳統的表型識別方法的缺陷。
2． DHPLC技術可以高度準確地檢測耐藥基因突變。
3． DHPLC技術具有從混合微生物群落中識別突變種類的能力。
在微生物方面套用的展望
DHPLC技術檢測微生物可廣泛套用於下列領域
1、出入境檢驗檢疫。
2、疾病預防控制中心（CDC）。
3、醫院臨床檢驗。
4、工業微生物檢驗，如食品安全檢測、藥品檢驗、化妝品檢驗、飲用水檢驗、一次性用品檢驗。
5、環境微生物監測。
醫學分子生物學及基因診斷方面
分子遺傳病學的研究
腫瘤流行病學的研究
基因甲基化狀態及甲基化程度分析
種群研究
法醫學和親子關係研究
與基因相關聯疾病基因診斷研究
分子生物學技術質量控制
動植物遺傳育種及基因組功能研究方面
動物遺傳育種及種群研究
優良基因篩選，SNP檢測，快速基因型鑑定
直接雜合子及純合子鑑定
動物線粒體DNA分析，可進行低突變率樣品的檢測，有效解決線粒體DNA異質
植物育種及功能基因組研究，高通量植物基因組SNP篩查
