片段分析(Fragment analysis)

片段分析(Fragment analysis,FA)是一種分子生物學技術,這裡的片段特指以DNA或者cDNA為模板,由PCR過程所產生的,數目不等的核苷酸構成的大小不等的DNA片段,對這些片段,利用其大小或者標記螢光的差異,進行分析的方法。被廣泛的套用於醫學、環境、農業研究等領域的基因型分型、DNA指紋分析、突變檢測等。

基本介紹

  • 中文名:片段分析
  • 外文名:Fragment analysis
  • 套用領域:醫學、環境、農業研究等領域
  • 概述:是一種分子生物學技術
  • 具體套用:基因型分型、DNA指紋分析等
  1. FA技術原理
從生物樣本,如組織、血液、痰液中提取核酸(DNA、RNA),製備相應的模板、引物,進行多重PCR,然後採用凝膠電泳、PAGE電泳、HPLC、DHPLC、毛細管電泳等方法中的一種進行DNA片段分析,最後將獲得的數據進行處理。
先進片段分析(Advanced fragment analysis,AFA),是片段分析中較為領先的技術。原理是設計針對不同目標靶點的引物,每個靶點擴增得到的產物至少有1bp以上的差別。交第三方合成引物並在末端標記螢光,不同大小片段採用不同顏色螢光標記,進行多重聚合酶鏈反應(PCR),使得所有靶點的核酸片段都帶螢光標記(圖A)。產物預處理後,進行毛細管電泳,利用螢光檢測器對不同片段大小的產物進行識別和區分(圖B)。使用軟體分析數據來決定以下結果:
1) 大小:分析軟體利用每種樣品中的標準尺寸為每種樣品創建一條標準曲線,
然後通過螢光標記片段與標準曲線的比較獲得片段的相對大小。
2) 基因型:分析軟體根據用戶自定義的基因位點來分配等位基因。
  1. FA操作過程
生物樣本
痰液
組織
血液
核酸提取
RNA
DNA
cDNA
模板
多重PCR
片段分析
毛細管電泳
PAGE電泳
DHPLC
HPLC
凝膠電泳
數據分析
  1. FA發展歷史
  2. a) 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重複性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。遷移速度與核酸分子本身的大小和構型有關,相同電場強度下,分子量較小的DNA分子遷移較快。
瓊脂糖凝膠分離DNA片段大小範圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。其解析度雖比PAGE電泳低,但它製備容易。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。裝置如圖所示:
  1. PAGE電泳
聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis,簡稱PAGE),是以聚丙烯醯胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯醯胺凝膠為三維網狀結構,具有分子篩效應。
聚丙烯醯胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辨力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯醯胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但製備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯醯胺凝膠採用垂直裝置進行電泳。
  1. HPLC|DHPLC
高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)以液體為流動相,採用高壓輸液系統,將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內各成分被分離後,進入檢測器進行檢測,從而實現對試樣的分析。
變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromatography \ DHPLC),在部分變性的條件下,通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異,發現DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同,在部分變性條件下,異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性,在色譜柱中的保留時間短於同源雙鏈,故先被洗脫下來,在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線。
DHPLC是一種基因突變篩查技術,能夠自動化、高通量進行,且除PCR之外,勿需進行PCR引物修飾、購買特殊試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。DHPLC靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動範圍廣、相對價廉。檢測每個樣品只需要8分鐘左右,且能夠純化DNA片斷。只能檢測雜合突變是DHPLC的不足之處,但是可以通過純合突變樣品和野生型樣品混合的方法來解決。
  1. 毛細管電泳
毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)又稱高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。毛細管電泳實際上包含電泳、色譜及其交叉內容,它使分析化學得以從微升水平進入納升水平。
毛細管電泳通常使用內徑為25-100μm的彈性(聚醯亞胺)塗層熔融石英管。具有:高效、快速、微量、儀器簡單、易自動化、操作方便、套用範圍廣等優點。
  1. FA技術特點
傳統的基因片段分析建立在凝膠電泳基礎上,利用片段大小以及電荷不同對核酸產物進行分離和分析,儘管套用普遍、成本較低,但是卻存在以下缺點:操作繁瑣;解析度低,無法精確度量基因片段的鹼基數;有EB污染,嚴重危害人類健康。
先進FA檢測技術的核心內容是多重PCR技術以及毛細電泳系統分離。在同一個PCR反應體系中包含多對引物,各引物特異性地結合相應的目的基因,進行多重PCR;通過毛細管電泳系統可對不同片段長度的PCR產物進行分離和識別,同時,根據峰面積的大小還可對不同產物進行定量分析。先進FA包含以下幾種先進的技術:
  1. 高特異性等位基因多重分析(Multiplexing Allele Specific Assay, MASA):能在一個反應中同時分析多達15個SNP位點,可用於藥物基因組學分析;
  2. 高靈敏度高特異性病原體分析(High Sensitivity Pathogen Specific, HSPS):在一個反應體系裡面同事檢測與識別多個低拷貝數的病原體,用於感染性病原體的多重檢測。
傳統PCR僅套用一對引物,通過PCR擴增產生一個核酸片段,主要用於單一致病因子等的鑑定。
多重PCR特點:①高效性,在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物,或對有多個型別的目的基因進行分型,特別是用一滴血就可檢測多種病原體.②系統性,多重PCR很適宜於成組病原體的檢測,如肝炎病毒,腸道致病性細菌,性病,無芽胞厭氧菌,戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢.③經濟簡便性,多種病原體在同一反應管內同時檢出,將大大的節省時間,節省試劑,節約經費開支,為臨床提供更多更準確的診斷信息。
毛細管電泳特點:容積小(一根100 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL);側面/截面積比大,因而散熱快、可承受高電場(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質;在溶液介質下能產生平面形狀的電滲流。
由此,可使毛細管電泳具備如下優點:
(1)高效:塔板數目在10-10 片/m 間,當採用CGE 時,毛細管電泳色譜圖,塔板數目可達10 片/m 以上;遠高於高效液相色譜;
(2)快速:一般在十分鐘內完成分離,快的僅需三分鐘;
(3)微量:進樣所需的樣品體積為nL 級;
(4)儀器簡單、易自動化;
(5)操作方便;
(6)套用範圍廣。
與直接測序相比:某一個基因位點是比較容易得知的,但要獲得一段完整的基因序列就很困難,若是得不到就無法進行直接序列比較。而如果標記離基因位點很近,那么可以通過標記分析推斷出突變基因的存在。標記分析要比直接基因測序快很多。
  1. FA相關套用介紹
  2. a) 臨床方面
i. 病原微生物
片段分析能夠準確、快速地檢測出致病的病原微生物。
按照疾病傳播途徑的不同,大致可以分為:蟲媒、呼吸道、寄生蟲、接觸、胃腸道、血液等。片段分析在這幾類疾病的病原微生物診斷套用中的成效顯著。例如,Jian Li, Yanhui Zhang等人研究了瘧原蟲的簡單重複序列(SSRs),區分了近600種用多態微衛星標記的約氏瘧原蟲基因組。
除了對傳播瘧疾的瘧原蟲的研究,片段分析還被廣泛地用於呼吸道疾病的研究,如麻疹病毒、致肺結核的分支桿菌、水痘病毒、H1N1流感以及雞瘟病毒等。Maria A. Nagel, Don Gilden等人運用逆轉錄PCR技術和基因圖譜分析系統(GeXPS)以及毛細管電泳和螢光分析技術,克服了宏陣列和微陣列分析不能檢測潛伏在人神經中樞的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)基因的缺點,該技術能夠快速分析VZV在人神經系統潛伏期時的所有基因轉錄 。除了上述幾位研究人員,Meng Qin, Da-yan Wang等人也運用了GeXP基因分析系統研究了H1N1流感病毒,研究發現該方法具有較高的靈敏度和特異性,並且該法可以用來檢測潛伏的混合感染,為流行性感冒的監管提供了強有力的方法,同時也提供了一個研究相似病原體變異的平台。而Jin Li, Nai-Ying Mao等人運用多重逆轉錄PCR技術和GeXP系統,對16種人呼吸道病毒進行了同時檢測,結果顯示這是一種快速的、高成本效益的、靈敏的、具有特異性且高通量的檢測呼吸道病毒感染的方法。
片段分析在寄生蟲方面也有研究套用。如利什曼蟲, Rolando Oddone,Carola Schweynoch等人運用多位點微衛星分型分析技術(MLMT)根據15個獨立位點來識別利什曼蟲,結果證明MLMT適用於利什曼蟲亞屬的流行病學和菌株群體遺傳學的研究。
通過接觸傳播的如腺病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)等。低危性HPV引發扁平疣、尋常疣等疣,高危性HPV引發陰莖癌、宮頸癌、直腸癌等癌症。Meng-Jie Yang, Le Luo等人採用多重PCR和GeXP分析儀對11種人乳頭瘤病毒(其中包括9中高危型和2種低危型)進行檢測,結果表明GeXP-PCR是一種快速、高靈敏度、高通量的檢測多種HPV感染的方法。國內也有人運用GeXP-PCR對HPV進行檢測,如蘆春斌,楊夢婕等人利用該技術對5種不同亞型的HPV病毒進行檢測鑑別。
胃腸道傳播疾病方面研究如與手足口病的腸道病毒相關的檢測。目前已有的檢測方法有實時逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、內嵌套式PCR、限制性片段長度多態性-聚合酶鏈式反應(PCR-RFLP),這些方法都能夠鑑別不同血清的腸道病毒,然而實時RT-PCR和內嵌套式PCR只能檢測有限數量的血清,PCR-RFLP儘管能夠同時檢測多個血清樣本,可是價格卻比較貴,也很耗時耗人力,因此Xiumei Hu, Yong Zhang等人研究認為GeXP分析法是一種快速、低成本、高通量區分9種手足口病腸道病毒血清型的方法。
通過血液傳播的疾病如愛滋病、B肝、C肝等。它們均是由病毒引起的疾病,通過片段分析來檢測愛滋病病毒(人體免疫缺陷病毒HIV)、B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)等病毒的研究也有不少。肖信研究建立了用於廣西HIV-1流行毒株的實時螢光定量PCR方法,並對方法科學性進行評價,結果表明螢光定量PCR方法具有線性範圍廣,特異度高,重複性好,檢測下限低,檢測試劑穩定性好,並與國際標準的NASBA法檢測結果高度相關,與國內標準的試劑盒產品具有較好的一致性,能適應廣西地區不同HIV-1亞型;該方法實用、可行,在病毒載量檢測、早期感染檢測、治療病人的耐藥監測等方面具有良好的套用前景。尹菊囡採用多重巢式PCR技術研究構建一種快速、經濟、實用、可靠的同步檢測HBV、HCV和HIV-1的方法,結果表明該方法可同時檢測HBV、HCV和HIV-1,但其靈敏度和特異度需進一步鑑定。李桂明採用磁珠提取核酸技術建立了一種能同時檢測、鑑定和定量三種病毒的多重實時定量RT PCR檢測方法,將這種方法的靈敏度與Qiagen公司的病毒DNA和RNA提取試劑盒進行比較,結果表明它們有很好的相關性;且一種病毒核酸的擴增不會對其它兩種產生影響;該檢測體系具有很高的靈敏度,最低可達50拷貝/ml;與單重的檢測相比也顯示出很好的相關性;表明這種檢測體系有大規模用於獻血篩查的潛力。
ii. 個體化用藥
個體化藥物用藥是根據病人的年齡、身高體重、遺傳特徵等因素,選擇適合病人的藥物種類和劑量,來顯著提高藥物療效並減少藥物毒性的一種用藥方案。
統計數據表明,絕大多數藥物在約1/3的使用者中不能取得滿意療效,約1/6的使用者發生不同程度的不良反應,總的安全有效率僅約50%。目前藥物不良反應是人類第五大死亡原因。為在基因組學的基礎上,通過將基因表達或單核苷酸的多態性與藥物的療效或毒性聯繫起來,研究藥物如何由於遺傳變異而產生不同的作用,被稱為藥物基因組學。迄今已有100餘種藥物經美國FDA批准貼上了遺傳標籤,用於提示不同基因型的患者在套用該藥物時可能產生的療效和毒性。因此,通過基因檢測可針對性地為每位患者“量身定做”一套最適合的治療方案,從而最大程度地提高治療的有效率,減少藥物的毒副作用,避免用藥不當貽誤時機。
片段分析技術被廣泛套用於腫瘤領域,包括乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌等。有卵巢癌病史的家族中常伴隨著BRCA1以及BRCA2基因突變,Herman等人通過多重連線探針擴增技術(MLPA )分析BRCA1基因,對產物大小進行分析,意外的發現了在該基因的外顯子11有一段374bp的序列缺失,然而用傳統的測序法並未發現該現象。Pham等人通過小髮夾狀RNA干擾乳腺癌幹細胞的CD44,利用多重PCR結合片段分析法,經GeXP遺傳分析儀對幹細胞相關基因的基因表達水平進行了研究,發現通過干擾CD44,會使得乳腺癌幹細胞向非乳腺癌幹細胞分化,基因表達水平也更相似,這為乳腺癌的治療提供了一種新的潛在的治療方法。Sadava等人研究靈芝對小細胞肺癌的療效,利用GeXP基因表達分析系統對與細胞循環及細胞凋亡相關的36個基因進行了分析,發現其中經靈芝處理後的9個基因的表達水平與經化療藥物依託泊苷以及阿黴素治療後的不同。Dahan等人通過限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術以及CEQ的分型研究了與用於治療結腸直腸癌的西妥昔單抗藥效相關的潛在基因EGFR、EGF、CCND1、FCGR2A和FCGR3A的多態性,研究發現FCGR3A F158V以及CCND1 A870G的多態性對預測藥效、總生存數具有獨立重大的意義。Drew等人利用GeXP多重基因表達分析系統、微陣列晶片法及實時螢光定量法對結腸普通組織、息肉及腫瘤組織的炎症相關基因的表達水平進行了研究,結果表明GeXP表達譜分析法可實現同時對多個基因表達進行定量,相比實時螢光定量PCR方法,它更快速、價格更低,同時多個內參基因能確保基因表達水平的準確性。
在心血管疾病方面,也有用到片段分析方法進行相關研究。腎胺酶抗體具有血流動力學效應,它很可能參與調節心血管功能,Buraczynska等人通過PCR-RFLP方法對腎胺酶抗體基因上的3個SNP位點進行基因分型發現該基因的多態性與糖尿病第二類患者的高血壓相關,並發現rs10887800的等位基因G很可能會增加糖尿病患者中風的風險。LDLR基因的突變是家族性高膽固醇血症最常見的病因,而大片段基因重組在LDLR基因突變中所占比例高達10%,Goldmann等人利用MLPA方法首次發現非同源末端連線(non-homologous end joining, NHEJ)參與LDLR的基因重組。Botto等人利用測序並結合PCR-RFLP方法,研究LMNA基因的突變,該基因突變與擴張型心肌病密切相關,研究發現了在最常見的R190W突變旁邊有一類新的錯義突變R189W。張陽東等人還通過GeXP平台對冠心病相關基因表達分析中的管家基因的表達水平進行了比較,並提出β-actin和SRP14可作為檢測CAD相關基因表達水平的內參基因。寧波海爾施基因科技有限公司也非常關注心血管疾病相關研究,在AFA技術上開發了多項專利,如“一種指導華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法”已被授權,通過對藥物靶標及參與藥物代謝等基因的遺傳多態性的診斷,用於華法林抗凝的安全性指導;同時,還開發了針對β-受體阻斷藥用藥、噻嗪類利尿藥降壓藥以及血管擴張藥硝酸甘油的多重基因檢測試劑盒,目前正在審核過程中 。
片段分析方法還被用於其它疾病的研究,如淋巴細胞性白血病、肌萎縮、抑鬱症等 。
iii. HLA分型
在組織或器官移植中供者與受者之間相容(不排斥)還是不相容(排斥)都是由它們組織特異性所決定的。這種代表個體特異性的組織抗原稱組織相容性抗原,一套這樣的抗原系統稱主要組織相容性系統(major histocompatibility system,MHS)。編碼MHS的基因群稱為主要組織相容性複合體MHC。人的MHC就稱HLA(human leukocyte antigen),是迄今已知基因中等位基因多態性最高的基因複合體。 HLA包括有I類II類和III類基因部分。實踐證明,HLA相同的同胞供者的腎移植,90%以上效果良好;單體型不同的供者,效果明顯下降;兩單型皆不同者則很少存活。
以往,用於HLA分型的方法主要是血清學和細胞學方法,由於其方法學上的缺點,分型的準確性較差,且不能進行亞型分析。最近幾年,隨著分子生物學的不斷進步,特別是PCR技術的廣泛套用,HLA基因分型技術得到了迅速的發展,各具特點的不同HLA基因分型技術不斷出現,在方法學上達到了穩定、準確、精細、簡便、實用的程度,為其臨床推廣套用奠定了技術基礎。鄔於川等人套用PCR-RFLP(限制性片段長度多態性)方法進行了HLA-DP B1 等位基因與四川漢族人哮喘的相關性研究。黃飛等人進行PCR-SSP(序列特異性引物)/PCR-SBT-HLA(直接測序分型) 高分辨等位基因分型比較, 發現兩種方法具有實驗互補意義。若同時套用兩種方法能夠有效改善HLA 等位基因高分辨分型的準確性和重複一致率。
值得注意的是,目前臨床用血多為成分輸血,成分血分離自全血,不可避免會殘留少量白細胞或血小板。而有核細胞或血小板表面存在的HLA會隨著輸血進入患者體內,異體HLA抗原可對患者的HLA分型判定產生干擾。現報導1例接受過多次大量成分血輸注治療的重型再生障礙性貧血患者,由於未嚴格按HLA分型血標本規定時間間隔進行血標本採集,導致HLA低分辨基因分型結果無法判定。
  1. 親權鑑定
古代滴血認親的方法,造成了不少冤案。如今,有了片段分析法,就可以快速、準確的鑑定親權關係。
楊玉發等人,採用PCR複合擴增技術、毛細管電泳及五色螢光自動化檢測技術對143例親權鑑定案例389份血液樣本,進行了15個STR基因位點和1個Amelogenin性別基因位點檢測分析,得出結論:STR基因檢測位點多,多態性高,DNA片段短、造成錯配和優先擴增的可能性小,提高了PCR擴增的成功率和靈敏度,而且標本用量少(一般僅為0.1ng模板DNA),因此,STR基因位點檢測技術可以作為親權鑑定的主要技術手段。潘猛等人,取2011~2012年來自江蘇省的262份無血緣關係的漢族個體,對24個STR位點進行複合擴增,ABI3130自動基因分析儀進行片段分析並進行基因分型,分析了24個Y染色體短串聯重複序列(STR)基因座在江蘇漢族群體的基因多態性、基因頻率和其他地域人群之間的遺傳距離。
  1. 其他方面
產前診斷、個體識別等

相關詞條

熱門詞條

聯絡我們