色譜圖是指被分離組分的檢測信號隨時間分布的圖象。樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線。色譜圖形狀隨色譜方法和檢測記錄的方式不同而不同，迎頭色譜和頂替色譜的色譜圖為一系列台階；在洗脫法色譜中，若採用微分型檢測器時，分離組分的檢測信號隨時間變化的圖形為近似於高斯分布的一組色譜峰群，色譜圖的縱坐標為檢測器的回響信號，橫坐標為時間、體積或距離。
基本介紹
- 中文名：色譜圖
- 外文名：chromatogram
- 別名：色譜流出曲線
- 圖像：信號-時間曲線
- 相關儀器：色譜柱和檢測器
- 相關術語：基線，色譜峰的高度、寬度等
相關術語,常見問題,
相關術語
進樣後記錄儀記錄下來的檢測器回響信號隨時間或載氣流出體積而分布的曲線圖稱為色譜圖(chromatogram)或色譜流出曲線(圖1)。曲線上突起的部分就是色譜峰，根據色譜圖的出峰時間和峰面積(或峰高)進行定性定量分析，為此色譜圖中規定了一些專有名詞及術語。
圖1 色譜圖
圖1 色譜圖基線
在實驗操作條件下，當沒有組分即僅流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線。
①穩定的基線：是一條水平直線，是測量基準，也是檢查儀器工作是否正常的指標之一。
②基線噪聲(baseline noise)：指由各種因素引起的基線起伏。
③基線漂移(baseline drift)：指基線在一定時間內對原點產生的偏離，稱為漂移。
色譜峰的高度、寬度
①峰高h：峰最高點至基線的垂直距離，稱為峰高h，一般以mV或mm、cm表示。分析條件一定時，峰高是定量分析的依據。
②峰寬(peak width)或稱區域寬度，它的大小反映色譜柱或所選色譜條件的好壞，峰寬有以下三種表示方法。
a. 標準偏差(standard deviation)σ：標準偏差是指0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半，圖1中EF的一半，用σ表示。
b. 半峰寬(peak width at half-height)Y1/2：半峰寬是指峰高一半處色譜峰的寬度，圖1中的GH，用Y1/2表示。
c. 峰底寬度(peak width at peak base)Y：峰底寬度是在流出曲線拐點處作切線，分別相交於基線上的I和J處之間的距離。常用Y表示。
標準偏差與峰底寬度和半峰寬的關係如下：
Y1/2=2σ
=2.354σ
Y=4σ
色譜保留值
保留值表示試樣中各組分在色譜柱中的滯留時間的數值，通常用時間或將組分帶出色譜柱所需流動相的體積表示。
用時間表示的保留值反映被分離組分在色譜柱中的滯留時間，主要取決於它在兩相間的分配過程，因而保留值是由色譜過程中的熱力學因素所控制的。在一定的固定相和操作條件下，任何一種物質都有一個確定的保留值，該保留值可用作定性參數。
①死時間(dead time)tM ：它是不被固定相吸附或溶解的組分(如氣一液色譜的空氣峰等)的保留時間(即不與固定相相互作用的組分，從進樣開始到柱後出現濃度最大值時所需的時間，稱為死時間)，反映了流動相流過色譜系統所需的時間，因此也稱為流動相保留時間。
②保留時間(retention time)tR：即組分從進樣開始到柱後出現濃度最大值時所需的時間，稱為該組分的保留時間。
③調整保留時間(adjusted rentention time)t'R：指扣除死時間後的保留時間。
t'R=tR-tM
保留時間是色譜法定性的基本依據。但同一情況下，同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。
④死體積(dead volume)VM：從進樣器到檢測器之間空隙體積的總和，包括色譜柱在填充後柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連線頭間的空間以及檢測器的空間。當後兩項很小且可以忽略不計，只考慮色譜柱中固定相顆粒間的空隙體積時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣體積流速F0來計算。
F0=tM×F0
式中，F0為在柱溫為Tc(K)、柱出口壓力為p0(MPa)時體積流量，mI·min-1。
體積流量是在柱出口處用皂膜流量計測定的。用這個方法測得的Fa值僅表示在室溫下柱出口處的流量，這個值應該校正到柱溫和乾燥氣體的情況下(排除皂膜流量計中水蒸氣的影響)：
F0=Fa×Tc/Ta×（p0-pw）/p0
式中，Tc為柱溫，K；Ta為室溫，K；p0為大氣壓力；pw為室溫下水蒸氣的分壓。
⑤保留體積VR(retention volume)：指從進樣開始到柱後被測組分出現濃度極大值時所消耗流動相的體積。可由保留時間與色譜柱出口流動相體積流量的乘積來計算。
VR=tR×F0
當流動相流速F0加大時，保留時間tR相應降低，兩者乘積仍為常數，因此VR與流動相速率無關。
⑥調整保留體積V'R(adjusted retention volume)：只扣除死體積後的保留體積。
常見問題
色譜圖常見問題主要有兩類：色譜峰峰形異常(例如負峰，寬峰，肩峰，雙峰，峰形不對稱等)以及色譜峰保留時間問題(保留時間不穩定等)。
色譜峰峰形異常問題
(1)色譜圖中未出峰：進樣問題(未進樣或樣品分解)；流動相問題(泵未輸液或流動相不正確)，檢測器設定不正確或檢測器有問題。
(2)一個或幾個峰是負峰：流動相吸收本底高；進入空氣；離子對分離中的系統峰；樣品組分的吸收(RI或UV)低於流動相。
(3)所有的峰均為負峰：信號電纜接反或檢測器輸出極性設定顛倒；光學裝置尚未達到平衡。
(4)所有的峰都是寬峰：系統未達到平衡；溶樣的溶劑比流動相強很多；色譜柱類型或尺寸不正確；色譜柱或保護柱被污染或降級；溫度變化對色譜柱的影響。
(5)較早洗脫的峰呈寬峰：進樣體積過大或樣品濃度太高；進樣器有問題，定量環(loop)大小不合適；線上過濾器、保護柱、色譜柱或管路堵塞；管路問題(內徑不對或切管不正確)；管路連線問題(接頭或錐箍不正確)；檢測器時間常數不正確。
(6)峰比預想的要小：樣品黏度過大；進樣器有問題或進樣體積有誤；檢測器設定不正確，定量環體積不正確；檢測器輸出未置零；用了不正確的檢測器輸出信號；檢測池被污染；檢測器的燈可能有問題。
(7)雙峰或肩峰：進樣量或樣品濃度過大；保護柱或色譜柱進口堵塞；保護柱或色譜柱污染或失效。
(8)前伸峰：進樣量或樣品濃度過大；溶樣的溶劑相對於流動相太強；保護柱或色譜柱污染或失效。
(9)拖尾峰：保護柱污染或色譜柱失效；進樣問題；檢測器時間常數不正確。
(10)平頭峰：檢測器設定不正確；進樣體積太大或樣品濃度太高。
(11)流動相洗滌強度南弱漸強時出現很多雜質峰：強溶劑將弱溶劑洗不出的雜質衝出來了，不影響柱的性能。
(12)在UV色譜圖中，靠近死時間處出現負峰：進樣時壓力波動所致；樣品溶劑比流動相的UV吸收值低。
進樣量與峰面積不是線性關係
原因：樣品在流動相中的溶解度小，只有部分樣品被流動相衝入色譜柱中而另一部分則沉積在柱入口端。
實驗的重複性差
原因：柱被污染，鍵合相流失，樣品溶劑不同，樣品穩定性不好，溫度波動，流動相組成改變，緩衝液的pH值不合適，緩衝液的緩衝能力不足。
回收率低
原因：不可逆吸附．固定相過強或流動相過弱，非特異性吸附。
色譜峰保留時間問題
(1)保留時間飄忽不定(各次運行之間)：系統不穩定或未達到平衡；泵壓力不穩，有氣泡；進樣體積過大或濃度過大；溫度波動；流動相混合不均勻；色譜柱被污染。
(2)保留時間增加或減少(各次運行之間)：系統未達到平衡；泵流速變化；溫度變化；柱污染，柱效下降；流動相被污染；溶劑入口過濾器堵或管路堵塞；系統滲漏。
(3)保留時間改變到一個新的恆定值：流動相不正確或其組成不正確；泵流速變化；實際輸液的流速不正確(泵失靈或故障)；溫度變化；色譜柱尺寸或類型不正確；柱被污染；流動相含有穩定劑或穩定劑發生變化；輸液系統的梯度滯後體積不正確。
