高效液相色譜分析法

高效液相色譜以經典的液相色譜為基礎，是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經典的液相色譜。所用的固定相為大於100um 的吸附劑（ 矽膠、氧化鋁等）。這種傳統的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質擴散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進行簡單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小（5um-10um）、傳質快、柱效高。

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代後期發展起來的一種分析方法。近年來，在保健食品功效成分、營養強化劑、維生素類、蛋白質的分離測定等套用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定。

基本介紹

• 中文名：高效液相色譜分析法
• 外文名：High performance liquidchromatography，HPLC

基本信息

高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達29.4MPa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬);同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。

特點：

1.高壓：液相色譜法以液體為流動相(稱為載液)，液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×10⁵Pa。

2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。

3. 高效：HPLC的分離效率高於普通液相色譜，在發展過程中又出現了許多新型固定相，使分離效率大大提高。

4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如螢光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般微升。

5. 適應範圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於套用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大(大於 400 以上)的有機物(這些物質幾乎占有機物總數的 75% ～ 80% )原則上都可套用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

分析原理

高效液相色譜分析的流程

由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然後輸出，經流量與壓力測量之後，導入進樣器。被測物由進樣器注入，並隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離後進入檢測器，檢測信號由數據處理設備採集與處理，並記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到複雜的混合物分離（極性範圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程式升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，

而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

高效液相色譜的分離過程

同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配係數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。

開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配係數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配係數大的組分C 在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配係數介於A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配係數的不同先後流出色譜柱，達到分離之目的。

不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決於各組分在兩相間的分配係數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散係數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。

類型

吸附色譜

在吸附色譜中，樣品的極性官能團牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團的種類、數量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應是能溶解於有機溶劑並是非離子型的，強離子樣品是不適宜的。

吸附色譜所使用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進一步減小百分數。因為高濃度的醇會減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，並使重現困難。

分配色譜

1.正相分配色譜

正相分配色譜適用於不溶於水而溶於有機溶劑且帶有極性基團的樣品，但正相分配色譜不適合於離子型物質。

2.反相分配色譜

這種方法套用非常廣泛，套用的範圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。

通過使用的流動相是水—甲醇和水—乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調節分離，但如果樣品帶有離子型基團，需要在流動相中加入鹽或調節流動相的PH值，例如，如果樣品有一個—COOH 基團，使流動相的PH值是偏向酸性的，由於抑制了—COOH基團的電離而加強了保留。這個方法叫離子抑止法，如果樣品有強離子基，有時候採用在流動相中加入適當抗衡離子以形成離子對的離子對法。

在調節PH值中，保持PH值在填料說明書手冊中所規定的範圍內，大多數化學鍵式的二氧化矽使用在PH=2-9，然而，當加入鹽以後，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能套用非常廣泛的PH值。

離子交換色譜

這個方法是用填料的固定相的離子交換基團和樣品的離子基團之間的離子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。

離子交換色譜使用於能溶於水的離子型物質。在離子交換色譜中，流動相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因為氯化物會腐蝕不鏽鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCl或其他的氯化物鹽類。根據測量波長有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當檢測處在短波端的時候，用醋酸作流動相是不合適的。

凝膠色譜

凝膠色譜不同於以上三種分離方法。凝膠色譜是根據分子大小用分子篩效應來分離樣品組分的。這個方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經常用作填料。

因為在樣品中，小尺寸的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機溶劑作流動相，叫做凝膠滲透色譜。

凝膠色譜依樣品的性質又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。

1.凝膠滲透色譜

凝膠滲透色譜（Gel　Permeation　Chromatography），簡稱GPC。此一類的色譜，使用於有機性溶媒的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform等等。

2.凝膠過濾色譜

凝膠過濾色譜（Gel　Filtrarion　Chromatography），簡稱GFC。此一種類的層析法，使用於水溶媒的試劑中，如蛋白質、澱粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩衝液等等。

凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機膠和無機膠。按其製備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據凝膠的強度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據它對溶劑的適用範圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。

套用

1 作為分析手段使用

分為單獨使用和與其他分析設備配套使用兩種形式。

單獨使用的套用範圍已經十分廣泛，是常規的儀器分析手段，相關的國家標準也很多，2015年正在執行的已經超過600項。

比如：

GB/T 30388-2013 辣椒及其油樹脂 總辣椒鹼含量的測定 高效液相色譜法

GB/T 25224.2-2010 動植物油脂 植物油中豆甾二烯的測定 第2部分:高效液相色譜法

GB/T 17528-2009 胡椒鹼含量的測定 高效液相色譜法

配套使用主要是與質譜等設備聯用，能夠有效的確定混合物樣品或者是未知物樣品的組分。

比如：

GB/T 29664-2013 化妝品中維生素B3(煙酸、煙醯胺)的測定 高效液相色譜法和高效液相色譜串聯質譜法

GB/T 23217-2008 水產品中河豚毒素的測定 液相色譜-螢光檢測法

2 作為微量分離手段使用，詳見“製備色譜”詞條

稱之為高效液相製備色譜。在將物質分離後進行分別收集，實現微量物質的分離。

這在高端化學品，比如手性藥物中間體的製備中，非常常見。