PfuDNA聚合酶（Pfu DNA polymerase），又稱Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜熱的古核生物火球菌屬內發現的，一類能在活體內進行DNA複製的酶。該酶含有2個蛋白亞基(P45和P50),為多聚體,分子量約為90kDa。該酶同時具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性,因此在聚合反應中可糾正錯誤摻入的鹼基,忠實性極高。體外實驗中，在聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的擴增DNA片段。
Sso7d是來源於Sulfolobus solfataricus的一種雙鏈DNA結合蛋白,與DNA聚合酶融合後,聚合酶的進行性得到了顯著的提升,而其對聚合酶催化活性和熱穩定性沒有影響。
基本介紹
- 中文名：PfuDNA聚合酶
- 外文名：Pfu DNA polymerase
- 又稱：Pfu聚合酶，或Pfu酶
- 發現地：嗜熱的古核生物火球菌屬內
- 酶類型：在活體內進行DNA複製的酶
Pfu聚合酶的校正作用,Pfu聚合酶鏈式反應的作用與優點,Pfu DNA聚合酶用途,Pfu DNA聚合酶使用建議,
Pfu聚合酶的校正作用
與其它在PCR反應中使用的聚合酶相比，Pfu聚合酶有著出色的熱穩定性，以及特有的“校正作用”。與TaqDNA聚合酶不同，PfuDNA聚合酶具有3'-5'外切酶的即時校正活性，可以即時的識別並切除錯配核苷酸。因此，使用PfuDNA聚合酶進行PCR反應，比使用Taq聚合酶有較低的錯配突變幾率，保真性更高。Pfu聚合酶正逐漸取代Taq聚合酶，成為使用最廣的PCR工具。
商業化的Pfu聚合酶試劑，其出錯率是100萬到130萬個鹼基對出現一個錯配，使用PCR每擴增1kb的DNA片段會產生2.6%的突變產物。但缺點是，Pfu聚合酶的效率較低。一般來說，在72° C擴增1kb的DNA時，每個循環需要1到2分鐘。而且使用Pfu聚合酶進行PCR反應，會產生鈍性末端的PCR產物。
Pfu聚合酶常常用於保真性要求較高的DNA合成中。有報導說，Pfu聚合酶與Taq聚合酶聯合使用，既能達到Pfu聚合酶的高保真性，又能發揮Taq聚合酶的快速聚合活性。
補充：
此酶催化DNA合成的忠實性比Taq酶高12倍，最適延伸溫度為72~78攝氏度，PfuDNA聚合酶耐熱性極好，97.5攝氏度時的半衰期大於3小時。在無dNTP時，PfuDNA聚合酶會降解模板DNA，因此反應時一定要最後加入該酶到反應的混合物中。由於該酶加入低鹽緩衝液。
20mmol/LTris.HCl,
pH8.2,
10mmol/LKCl,
6mmol/L硫酸銨
1.5mmol/L氯化鎂
0.1%Triton X-100,
10ng/ulBSA
一般耐熱DNA聚合酶擴增片段長度小於5kb，是PCR技術套用受到一定限制。Boehringer公司新近推出一種Expand 長片段擴增系統，其擴增片段可長達40kb。
Pfu聚合酶鏈式反應的作用與優點
聚合酶鏈式反應,因為其方便,快捷,準確地大規模複製目的基因片段的能力,已經成為了分子生物學不可或缺的技術手段,其在人類基因組計畫以及後續的人類蛋白質組計畫中都起著不可替代的作用。至其誕生以來,在全世界各國科學家的共同努力下,該技術已經獲得的長足的進步。如熱循環儀的發明,大大節約了反應時間,節省了研究者的精力;逆轉錄聚合酶鏈式反應則可用於檢測細胞/組織中基因表達水平,細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等;實時定量聚合酶鏈式反應的發明,則使得精確定量測定特定DNA片段個拷貝數成為可能。如今,該技術憑藉其諸多優勢,在諸多領域,如醫學檢測、感染性疾病檢測、法醫學檢測分子進化等,成為無法取代的技術手段。作為聚合酶鏈式反應中的核心工具,DNA聚合酶在聚合反應中極為重要,其性能會直接影響產物的特異性、產量、保真性等各種特性。因此,高性能的DNA聚合酶的獲得對分子生物學實驗來所就顯得非常關鍵。通過篩選高性能熱穩定性聚合酶、融合特定輔助_蛋白、選擇合適的表達系統、最佳化蛋白表達及純化、降低成本等方法,科學家希望獲得性質更加穩定高效,成本更加低廉的DNA聚合酶。
Pfu DNA聚合酶用途
用於要求保真度比較高的PCR反應，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成等。
Pfu DNA聚合酶使用建議
Pfu DNA聚合酶產生的PCR產物為平滑末端，無3’端"A"突出，其PCR產物的克隆有兩種方案。
1. PCR前引物進行5’端加磷修飾或將PCR產物磷酸化處理後再直接克隆於平滑末端的載體中。
2. 將產物3’末端加A後再與T-Vector連線。
3. 由於Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30鹼基。另外為了減少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解，儘量在冰上配置反應體系，並最後加入Pfu酶。
1. PCR前引物進行5’端加磷修飾或將PCR產物磷酸化處理後再直接克隆於平滑末端的載體中。
2. 將產物3’末端加A後再與T-Vector連線。
3. 由於Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30鹼基。另外為了減少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解，儘量在冰上配置反應體系，並最後加入Pfu酶。
