PCR標記法

PCR標記法是在PCR反應底物中，將一種dNTP換成標記物標記成dNTP的一種方法， 這樣標記的dNTP就在PCR反應的同時摻入到新合成的DNA鏈上。這個過程通常以實驗圖的形式展示出來。

基本介紹

• 中文名：PCR標記法
• 外文名：無
• 參考資料：中國生物工程雜誌
• 優點：僅2～3h即可獲高效率標記的探針

摘要

從固體平板挑取轉化帶有目的基因的單菌落，用特異引物通過聚合酶鏈式反應可直接擴增和標記目的基因，不需經過菌的液體培養、質粒提取和酶解反應等複雜過程，能快速獲得目的基因擴增產物和進行目的基因探針的標記。

探針是核酸分子雜交及分子標記研究進行的必要前提，在Southern blot、Northern blot、ALFP、 RFLP、RAPD、SSR等技術中得到了廣泛套用，在分子生物學的研究中充分發揮著作用，尤其對核酸分子操作具有十分重要的意義。因此，探針的製備與標記已成為核酸研究中最常規和普遍的技術，但目前的探針標記方法主要是將質粒或λDNA 經限制性內切酶酶解後分離目的片段，再用切口平移標記法或隨機引物標記法進行標記，耗時很長且效率低，而用PCR聚合酶鏈式反應只須極少量的DNA模板（50～100ng），即可擴增出大量高效標記的目的片段，但仍需進行質粒的提取工作，最少也要2～3d才能完成全過程。為了進一步提高探針標記的效率，本試驗進行PCR方法直接從菌中標記目的基因的研究，僅需2～3h即可獲得高效率標記的探針，也可直接從具目的基因載體質粒中擴增出目的基因，同時適用於不需提取質粒DNA迅速鑑定細菌轉化的轉化子。 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

材料與方法

菌種

大腸桿菌DH5α（含有攜帶蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因（TuMV-cp）的表達載體質粒pBTU， npt Ⅱ篩選標記基因，Km），農桿菌R1000（Sm）， EHA105（Cm），LBA4404（Rif），以上菌種由本研究室保存。

試劑

Taq DNA聚合酶（Promega），pfu DNA聚合酶購於上海生工公司，DIG DNA Labeling and Detection Kit（Boehringer Mannheim）。PCR擴增反應引物為蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因兩端序列：引物1:5’-GCG TCG ACC ATG GCA GGT GAA ACG CTT G-3’引物2:5’-TGT CGA CTT TAT TCC CGG GTC ATA ACC CCT GAA CGC C-3’上海生工公司合成。

直接從菌中擴增目的基因方法

（1）常規方法從大腸桿菌DH5α提取表達載體pBTU質粒，用凍融法轉化農桿菌R1000， EHA105，LBA4404，獲得轉化子後提取質粒DNA。

（2）分別挑取DH5α和轉化的R1000、 EHA105、LBA4404單菌落，表達載體pBTU質粒為陽性對照，在冰上加入反應液至終體積20μl （表1），PCR反應程式：95℃預變性2～3min、94℃ 變性30s、60～65℃退火30s、72℃延伸1～2min、 25～30循環、72℃最終延伸7min、-20℃保存。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統檢測，鑑定和篩選含有目的基因的陽性轉化子，用紫外分光光度計檢測擴增產物的產量。

直接從菌中標記目的基因方法

（1）分別挑取具有目的基因的DH5α、R1000、 EHA105、LBA4404的單菌落，在冰上加入反應液至終體積50μl（表2），按如下程式進行PCR反應，95℃預變性2～3min、94℃變性30s、65℃退火 30s、72℃延伸2min、25～30循環、72℃最終延伸 7min、-20℃保存。

（2）在PCR擴增產物中加入5μl 5mol/L LiCl 和100μl-20℃預冷的無水乙醇沉澱，4℃， 12000r/min離心15min，70%乙醇洗沉澱，抽乾後用50～100μl TE溶解，如純度較低可通過凝膠回收純化試劑盒純化探針。將地高辛標記的探針進行點雜交檢驗，評估標記效率，PCR-Southern檢測進一步驗證探針的靈敏性。 表1、擴增目的基因反應體系

試劑 用量 最終濃度

無菌純水 14.9μl _ 10× 2μl 1×buffer（mg） dNTP 0.5μl 0.2mmol/L dNTP 引物 F1:0.4μl 0.1-1μmol/L F2:0.4μl 酶 Tap酶 1.0units 0.2μl 模板 1-2μl 可變總量 20μl _--

表2 標記目的的基因反應體系

_ 試劑 用量 最終濃度_ 無菌純水 35.5μl _ 10× 5μl 1×buffer（mg） 10×dNTP 5μl 0.2mmol/L （DIG-dNTP） dNTP 引物 F1:1μl 0.1-1μmol/L F2:1μl 酶 pfu酶 2.5units 0.5μl 模板 1-2μl 可變總量 50μl _

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結果與分析

（1）轉化的農桿菌R1000，EHA105，LBA4404 用鹼裂解法提取表達載體pBTU質粒，篩選到轉化子，計算轉化率約為10～10。單菌落的菌體用特異引物進行PCR反應後擴增出目的基因（圖1），進一步證實直接從菌中擴增目的基因片段的方法是可行的，經紫外分光光度計檢測擴增產物的濃度為0.1～0.5μg/μl。試驗發現某些已轉化的單菌落質粒拷貝數少導致提取質粒困難，經PCR擴增反應後有些單菌落擴增出具有目的基因的轉化子，其實際轉化率為10～10，可見 PCR擴增反應可快速鑑定出用質料提取方法無法確定出的轉化子，提高了鑑定水平和效率。

（2）單菌落的菌體用特異引物及DIG-11- dUTh進行PCR反應後擴增出目的基因，用PCR -地高辛標記的探針進行DNA斑點雜交試驗證實標記成功（圖2），通過標記探針與對照試驗的分析估算出合成的探針量為1～3μg。

（3）用10～20ng/ml標記好的探針與大白菜轉基因植株的PCR擴增產物進行Southern blot雜交，出現較強的雜交信號（圖3），證明標記的探針具有很高的靈敏性和準確性。

討論

（1）90年代初Mercier為簡化PCR樣品的製備過程，直接用全血的細胞作為模板擴增出目的DNA片段。1989年Koch等發明了一種引物介導的原位標記法（Primed in situ labeling）套用 Klenow片段來進行特異DNA片段的定位分析。 1990年Hasse等報導了使用Taq酶的原位PCR 反應，將DNA擴增和原位分子雜交巧妙結合，至此直接使用生物細胞或組織進行目的基因的 PCR反應和原位雜交技術成熟。本試驗利用 PCR方法直接從菌體中擴增和標記目的基因，是將引物介導的原位標記法和基因擴增過程合二為一。在PCR反應的94～95℃預變性2～5min 過程中菌體裂解，類似於煮沸法提取質粒的過程，使核酸物質釋放成為擴增的模板，摻入含有非放射性標記的dNTP（DIG-11-dUTP鹼不穩定型）經過25～30循環擴增出標記的目的基因。

（2）試驗中發現挑取的菌量對PCR擴增的效果影響很大。菌細胞濃度>10個/ml使破胞不完全，模板量不足，限制反應的進行，導致產量過低無法檢測，更不利於產物的進一步純化。菌細胞濃度<10個/ml，模板量不足，擴增產量低。加入濃度約為10～10個/ml的菌細胞，在預變性過程中延長時間或升高溫度以及使菌體處於單細胞是液狀態都有助於破胞和充分反應。

（3）用PCR方法進行特異探針的標記必須是在保證擴增反應的特異性、忠實性、有效性的前提下完成，而這3個檢驗擴增效率的指標又是相互制約的，且均受反應中的眾多成分和因素所影響。據此進行最佳化反應條件，為提高反應的特異性設計25～30個鹼基的引物，GC含量接近 50%，將退火溫度提高至65℃，在反應中加入 10%甘油以降低解鏈溫度和鏈分解溫度提高了退火引物的特異性。由於Taq酶不含核酸外切酶活性，在擴增中會以低而限定的速率產生錯誤，因此套用有3’→5’外切酶校正功能的pfu DNA聚合酶，減少擴增次數為25～30循環，使忠實性提高10～20倍左右，而進行目的基因鑑定時PCR反應的特異性和有效性更為重要，因此，使用Taq酶擴增即可得到良好的結果。由於地高辛標記的DNA合成速率只有未標記的DNA合成速率的一半，通常1000bpDNA在0.5～1min內可完全延伸，因此相應延長了標記反應的延伸時間為2min以提高產量。用於探針標記的PCR標準反應體系為50μl，總量太大影響標記的特異性和產量，試驗發現20μl反應體系完全適用於目的基因鑑定。

小結

此方法以單菌落為樣品無須大量的其它環節在2～3h內即可準確鑑定出轉化子，獲得目的基因並完成標記，尤其適於基因工程中工程菌株很難提取的低拷貝數質粒或單拷貝數目的基因的操作，僅需少量模板DNA即可完成常規方法難以進行的低拷貝數的目的基因的快速鑑定與標記，與其它製備探針方法相比在檢測低豐度、低拷貝數的目的片段時具有高靈敏度的優勢，是一種具有精確、高效、穩定、實用特點的方法，使試驗效率得到了大幅度的提高。

參考資料：中國生物工程雜誌