螢光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過螢光染料或螢光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時線上監控反應過程，結合相應的軟體可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。
基本介紹
- 中文名：螢光定量PCR
- 外文名：real-time PCR
- 目的：計算待測樣品模板的初始濃度
- 分類：絕對定量和相對定量
原理,套用領域,前景展望,操作步驟,樣品RNA的抽提,RNA質量檢測,樣品cDNA合成,樣品,模板,PCR,引物列表,電泳,
原理
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。或者使用螢光染料SYBR。SYBR可以結合到雙鏈DNA上面，當體系中的模板被擴增時，SYBR可以有效結合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進行，結合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測到的螢光信號越來越強，從而達到定量的目的。
螢光量化PCR原理套用領域
臨床疾病診斷：各型肝炎、愛滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合症、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標誌物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。
食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。
科學研究：醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。
套用行業：各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。
前景展望
實時螢光定量PCR的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定量。多種檢測系統的出現，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、重複性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。隨著生物晶片技術和螢光探針定量技術的結合，螢光定量PCR在醫學檢測及其他各個領域中的套用前景將更加廣闊，令人欣喜。儘管如此我們也應清晰認識到，FQ-PCR技術在我國各個研究領域的套用並不多見，這就需要我國學者迎頭趕上，使FQ-PCR技術更充分地推廣，以推動研究工作的快速發展。
操作步驟
螢光定量PCR 實驗步驟：
樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一乾淨無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，於4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反覆吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。
RNA質量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶於40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 μl，剩餘RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值範圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩衝液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩衝液
濃度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩衝液至覆蓋膠面幾個毫米。
②準備RNA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察並拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA製備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數位照相機拍下電泳結果。
樣品cDNA合成
①反應體系
序號 | 反應物 | 劑量 |
1 | 逆轉錄buffer | 2μl |
2 | 上游引物 | 0.2μl |
3 | 下游引物 | 0.2μl |
4 | dNTP | 0.1μl |
5 | 逆轉錄酶MMLV | 0.5μl |
6 | DEPC水 | 5μl |
7 | RNA模版 | 2μl |
8 | 總體積 | 10μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃乾浴3分鐘，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
③取出後立即95℃乾浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存於-80℃待用。
樣品
管家基因（β-actin）實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標準梯度製備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號 | 反應物 | 劑量 |
1 | SYBR Green 1 染料 | 10μl |
2 | 陽性模板上游引物F | 0.5μl |
3 | 陽性模板下游引物R | 0.5μl |
4 | dNTP | 0.5μl |
5 | Taq酶 | 1μl |
6 | 陽性模板DNA | 5μl |
7 | ddH2O | 32.5μl |
8 | 總體積 | 50μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系：
序號 | 反應物 | 劑量 |
1 | SYBR Green 1 染料 | 10μl |
2 | 內參照上游引物F | 0.5μl |
3 | 內參照下游引物R | 0.5μl |
4 | dNTP | 0.5μl |
5 | Taq酶 | 1μl |
6 | 待測樣品cDNA | 5μl |
7 | ddH2O | 32.5μl |
8 | 總體積 | 50μl |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③製備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。
模板
①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系：
序號 | 反應物 | 劑量 |
1 | 10×PCR緩衝液 | 2.5 ul |
2 | MgCl2溶液 | 1.5 ul |
3 | 上游引物F | 0.5 ul |
4 | 下游引物R | 0.5 ul |
5 | dNTP混合液 | 3 ul |
6 | Taq聚合酶 | 1 ul |
7 | cDNA | 1 ul |
8 | 加水至總體積為 | 25ul |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72℃延伸5分鐘。
②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
PCR
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下：
序號 | 反應物 | 劑量 |
1 | SYBR Green 1 染料 | 10 ul |
2 | 上游引物 | 1ul |
3 | 下游引物 | 1ul |
4 | dNTP | 1ul |
5 | Taq聚合酶 | 2ul |
6 | 待測樣品cDNA | 5ul |
7 | ddH2O | 30ul |
8 | 總體積 | 50 ul |
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40個循環，最後72℃7分鐘延伸。
引物列表
引物設計軟體：Primer Premier 5.0，並遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
