PCR晶片

實時定量PCR是檢測基因表達最靈敏、最可靠的方法，但由於實時定量PCR需要製備標準曲線和同時分析內參基因，因而每次實驗只能檢測少數幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。經過對實時定量PCR體系進行最佳化開發出的PCR晶片，可同時進行多種基因的研究，並且還可節省在數據分析方面所花費的時間，使研究者可以在更短的時間內得到更豐富的信息，PCR晶片可廣泛用於生命科學、生物技術、疾病檢測、臨床醫學和環境檢測等領域，是近年生命科學領域常用的研究手段之一。

基本介紹

• 中文名：PCR晶片
• 作用：實時定量PCR
• 用於：檢測基因
• 廣泛用於：生命科學

PCR晶片介紹

實時定量PCR是檢測基因表達最靈敏、最可靠的方法。通過在試驗過程中，實時監測螢光染料的信號變化可反映出樣品中的基因拷貝數，並且實時定量PCR線性範圍廣（能達到5個數量級），因此可以檢測同一樣品中表達量極低的基因和表達量很高的基因。但是，由於實時定量PCR需要製備標準曲線和同時分析內參基因，因而每次實驗只能檢測少數幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。通過簡單的以及經過最佳化的實時定量PCR體系，PCR晶片隨之開發出來，研究者可以同時研究大量基因，既可以進行某些特別感興趣的信號通路的研究，也可以作為驗證晶片結果的方法，PCR晶片可廣泛用於生命科學、生物技術、疾病檢測、臨床醫學和環境檢測等領域，是生命科學領域的研究熱點之一。

操作步驟

採用PCR晶片進行實驗只需2小時。PCR晶片實驗過程：首先將RNA樣品反轉錄為cDNA第一鏈，作為PCR模板；接著，將模板加入到反應體系（RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已經固定好基因特異性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反應體系，進行PCR反應。採用儀器配套的軟體計算PCR晶片中的每個基因的循環閾值（Ct）。最後，採用△△Ct方法比較對應的兩個樣本中同一基因的表達量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，可確定合適的標準化方法。晶片所設定的對照，可以檢測PCR體系中是否存在DNA污染，或者是否有影響反轉錄或PCR實驗步驟的因素存在。

技術難度

採用PCR晶片開展研究，技術上的難點是如何在同一次實驗中，相同的PCR反應條件下保證不同的基因有相近的擴增效率，並且獲得與單個基因實時定量PCR反應相當的靈敏度，特異性和可重複性。因此首先設計篩選出最佳的候選引物，接著通過實驗，在不同反應條件下，檢測PCR反應體系與幾千條PCR引物的組合，最終獲得了最佳化的引物和PCR反應體系，適應PCR晶片的要求。

檢測數量

根據一次實驗所檢測樣品數量的多少，可將PCR 晶片分為低通量和高通量 PCR 晶片。

低通量PCR 晶片的載體為 96 孔或 384 孔 PCR反應板，僅須將製備好的樣品cDNA 加入相應的反應孔內，在螢光定量PCR 儀上進行擴增即可。在靈敏度方面，每次擴增僅需400 ng 總 RNA。但低通量PCR 晶片所檢測的基因數量有限，而且無法進行多個樣品的多個基因的並行檢測。低通量PCR 晶片使用時和通常的定量 PCR 操作步驟相同，即從待檢的生物樣品（細胞、組織、血液等）中提取總RNA 或分離出 mRNA→經反轉錄形成cDNA→將所得的 cDNA 直接等量加入含有相應待檢測基因引物的孔中→加入PCR mix→在螢光定量PCR 儀上進行 PCR 定量檢測→數據分析。

高通量PCR 晶片是在固相載體上固定有成百上千個基因的特異性引物，並且可同時檢測高達成百上千個樣品，達到同時並行檢測多個樣品的多個基因表達的能力。因此，具有檢測通量高、耗時短和樣品用量少的優點。由Applied Biosystems公司研製的OpenArray System和Fluidigm 公司開發的BioMark System將螢光定量PCR 技術與高通量晶片技術相結合，屬於高通量PCR 晶片，但這些晶片必須在特定的定量PCR 儀器上使用進行。

優勢

PCR晶片與常規PCR相比：1. 整體性，PCR晶片作業系統採用多基因擴增、結果分析一體化，操作簡便；傳統的PCR採用單基因擴增及結果分析，操作繁瑣；2. 時間，PCR晶片檢測多個基因的時間是過去PCR檢測單個基因的時間；3. 試劑，傳統PCR對試劑用量有要求，15微升以下就很難得到理想的擴增結果，PCR晶片可以擴增10微升以下的樣品，這相應減少了試劑如Taq酶的用量，節省了實驗經費也減少了廢液污染。因此，與常規的PCR擴增技術相比，PCR晶片具有反應體積小、反應速度快、操作簡便、價格低、樣品用量少、無污染、節省試驗成本、便於集成化、結果可靠的優點。

套用

使用PCR晶片技術進行基因表達（信號通路或多個相關基因）的檢測，已普遍用於生命科學研究的多個領域，如疾病發病機制研究，為研究結腸癌的程式性死亡（包括細胞凋亡和自噬）狀態，Chang等套用PCR 晶片同時檢測癌症組織和正常組織中與細胞凋亡和自噬相關的22 個基因的表達情況，發現腫瘤組織的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的 mRNA 表達水平是正常組織的4.01 倍，而與程式性死亡和自噬相關的多個基因，包括腫瘤壞死因子受體（TNFR）、BCL2 相關蛋白（Bax）、半胱天冬酶 9（CASP9）、半胱天 冬 酶3（CASP3）及 損 傷 控 制 的 自 噬 調 節 子（DRAM）和抗紫外線相關基因（UVRAG）表達下調，說明腫瘤組織的代謝活性增加而凋亡速率降低，這可能是腫瘤組織增殖旺盛的原因。

Karén等運用人類血管生長相關基因的96 孔板PCR 晶片檢測了組蛋白脫乙醯基酶抑制劑丙戊酸在體外對人微血管周細胞的血管發生作用的影響。結果表明，經丙戊酸處理後，人微血管周細胞中有涉及內皮細胞存活的血管生成素樣4（ANGPTL4）和白介素-8（IL-8）、內皮細胞管成熟與穩定的成纖維細胞生長因子受體3（FGFR3）等 14 個基因表達改變，這些變化均可促進血管的穩定與成熟。提示PCR 晶片作為一種快速、準確的技術手段，可套用於藥物機理研究中。

在食品安全檢測中，李永新等建立了食品中沙門菌和單增李斯特菌的多重 PCR-晶片電泳快速檢測方法。根據沙門菌和單增李斯特菌的特徵基因合成2 對特異性引物，最佳化聚合酶鏈反應( PCR) 體系，採用晶片毛細管電泳快速檢測食品中上述2 種致病菌的多重 PCR 擴增產物。在最佳化的實驗條件下，6 min 內即可完成沙門菌和單增李斯特菌的同時檢測；遷移時間的日內精密度為0.20% ～1.7%，日間精密度3.7% ～4.5%。

發展方向

PCR晶片不僅成本低，而且試樣、試劑、人力三者消耗量均低， 速度也快， 靈敏度高。作為DNA分析的重要工序PCR，更是現代生物、醫藥不可或缺的部分，其設備的集成化，如樣品預處理系統、分離系統以及檢測系統等的集成使PCR晶片在生命科學、生物技術、疾病檢測、臨床醫學和環境檢測等領域繼續發揮重要作用。