基本介紹
- 書名：PCR技術檢測細菌
- 出版社：人民衛生出版社
- 開本：16
- ISBN：01-0109
書籍信息,檢測結核桿菌,PCR技術套用,
書籍信息
【書名】PCR技術檢測細菌
【ISRC】01-0109
【作者】西安交通大學
【出版社】人民衛生出版社
【出版單位】西安交通大學
【出版日期】2001
【片長】27分鐘
【語種】中文
【載體】VCD
【類別】醫學光
檢測結核桿菌
結核桿菌可以導致全身性疾病，特別是在開發中國家，其發病率較高，危害性極大.近幾年結核桿菌的變異性較大，對抗癆藥物的耐藥性增加，從而使結核病的發病大幅度增高.雖然傳統的塗片抗酸染色、細菌培養以及胸片檢查對大部分結核能作出正確的診斷，但對某些病人亦可造成誤診或漏診;動物接種雖特異性較高，但因時間較長，不能滿足臨床快速診斷的需要.近幾年也出現了幾種快速診斷方法，但也存在較大的缺陷，如短期培養後抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測BACTEC培養瓶中被培養標本所分泌的抗原，該方法可在BACTEC瓶本身鑑定出細菌之前，結合ELISA和塗片抗酸染色有效地鑑別典型和非典型分枝桿菌，敏感性較高，但存在培養時間長，重複性尚差的缺點.另一種是短期培養後核酸探針雜交法，即用特異性DNA探針與BACTEC瓶中培養的細菌染色體DNA雜交.該方法能有效地防止培養的假陰性結果，但卻易發生假陽性結果，加之採用的方法較為複雜和繁瑣，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近來已較少套用。上面兩種方法都要藉助細菌培養來進行，雖然在時間上比傳統培養大大縮短，但缺乏快速診斷的優勢。近幾年興起的PCR方法基本實現了快速、靈敏、準確地診斷結核的目的，並且該方法正趨於常規化地套用於臨床一般實驗室.套用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物。該引物所引導的DNA擴增序列應是結核桿菌獨有的，且是結核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測結果的特異性。PCR方法的另外幾個關鍵因素是：①DNA提取，即對有限的結核桿菌應儘量地將其DNA完整、全部地提取②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR產物的檢測方法，即將PCR產物進行快速、靈敏、安全、準確的檢測。 一、結核桿菌DNA的提取
在該技術上，目前仍無一種統一常規化的方法。現有各方法都存在著提取DNA不足的缺點，因此，敏感性受到影響.現在主要的細菌裂解方法是：①蛋白酶K加表面活性劑法，②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法，③反覆凍融法：④超音波法，⑤溶菌酶加表面活性劑法，提取DNA的方法主要有：①酚一氯仿提取法：即用酚一氯仿抽提含有裂解菌體的溶液，然後用乙醇從抽提後的溶液中沉澱DNA、有的學者將矽酮加入酚一氯仿中，使水相和有機相的界面更牢固，這樣不但能減少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加矽酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法：用二氧化矽(sio2)吸附裂解菌體釋放出的DNA，該二氧化矽用70%乙醇洗滌，而後乾燥，最後用雙蒸水洗脫(55℃)。有報導認為該方法可以消除痰中的某些抑制因子，有的學者發現未預裂解的結核桿菌直接煮沸進行PCR的效果與預先處理的相仿，提示結核桿菌不預裂解也可直接進PCR。但加入的菌數應<約1000個，否則細菌蛋白會對PCR產生抑制作用。
二、引物的設計
根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計。
(一)編碼結核桿菌抗原的基因序列
1.編碼65-KDa蛋白抗原的基因序列：結核桿菌65-KDa蛋白抗原為存在於所有分枝桿菌細胞壁中的熱休克蛋白，也是一種交叉反應蛋白，所以依據該序列設計合成的引物，PCR能擴增出所有分枝桿菌的靶DNA片段，沒有屬內特異性.這種PCR較適用於結核病高發區大規模篩選和流行病普查。另外，對65-KDa蛋白基因的PCR擴增產物進行限制性酶切分析(RFLP)，也可以準確地檢測出結核桿菌的屬內歸屬。
2.編碼MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白為結核桿菌複合群(MTBC，包括人型結核桿菌、牛型結核桿菌、BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)所特有。根據該蛋白的基因序列設計的引物進行PCR，對MTBC模板DNA顯示出高的特異性。
3.編碼38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:該序列僅存在於人型和牛型結核桿菌。採用在此基因內設計合成的引物和探針進行PCR，只能擴增人型和牛型結桿菌的DNA序列，能檢出少至10個結核桿菌的純化DNA。
4.編碼32-KDa蛋白的基因序列：32-KDa是蛋白分枝桿菌的一種分泌蛋白，由它的基因序列設計的引物和探針進行PCR，可以特異地檢測出分枝桿菌的DNA片段，能檢測出50fg的純化DNA，相當於10個結核桿菌。
5.編碼MPB70抗原的基因序列：MPB70為牛型結核桿菌所特有，由該基因序列設計的引物進行PCR，對牛型結核桿菌的檢測具有高度的特異性和敏感性。
(二)結核桿菌基因組重複序列
1.克隆DNA序列：目前所套用的DNA序列都是MTBC所特有，拷貝數在10個以上，包括亞克隆重組質粒pPH7301和克隆質粒PMTb4，分別含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段。根據這些基因序列設計的引物，其檢出限在20個結核桿菌以下。
2.插入序列：結核桿菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它們僅見於MTBC.這兩種插入序列在基因組中的拷貝數為1--20個，選擇插入序列作為擴增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性。尤其是IS6110，是目前進行臨床PCR檢測的首選區段。
(三)人型結核桿菌特異序列
mtp40是人型結核桿菌特異性DNA片段，Portillo等選擇mtp40作為靶序列，用PCR檢測結核桿菌，結果只能擴增人型結核桿菌DNA，敏感性達到10fg純化DNA量。
(四)分枝桿菌dnaJ基因
該基因為分枝桿菌共有，但種間又存在差別，在該基因序列內設計合成的引物和探針用於PCR檢測，能檢出50fg的純化分枝桿菌DNA，相當於10個結核桿菌.並可用於區分結核桿菌和非典型結核桿菌的鑑別診斷。
(五)rRNA序列
用“通用”引物在逆轉錄酶作用下，將16SRNA逆轉錄合成cDNA，然後對cDNA進行PCR擴增，檢出限達0.1fg化的結核桿菌rRNA.臨床標本中少至10個結核桿菌亦可被檢出，該方法由於加了一步反轉錄過程相對增加了難度，臨床一般少用.
三、PCR產物的檢測方法
通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電泳後，用溴化乙錠染色，然後在紫外燈下觀察或進一步採用標記的DNA探針雜交.為了進一步提高檢測的靈敏度，現多在引物和探針的標記上進行改進.由於放射性標記物的危害性，現多採用非放射性標記，如生物素、螢光素、酶及化學發光劑。Wilson等在巢式PCR的內側引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基。PCR產物上的生物素和附著在微型滴定板表面的生物素蛋白結合，使PCR產物附著在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶結合形成抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶偶合物，利用該偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)測定。另外，還可用吖啶酯標記探針進行雜交，用硼酸鈉將未雜交的探針分解，然後加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最後測量吖啶的光通量，雖然這些方法安全、快速、但其敏感性還需進一步提高，操作還需進一步簡化。 四、PCR檢測結核桿菌的敏感性和特異性
(一)PCR的特異性
PCR特異性的關鍵首先取決於所選靶序列的特異性.現在常用的靶序列有：①分枝桿菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列，②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列。③人型結核桿菌特異的靶序列，如mpt40序列.引物設計對PCR的特異性也至關重要.引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物的特異性和保守性，以及引物本身的許多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特異性和保守性及引物長度等都影響PCR的特異性，另外在設計引物時也要防止出現引物間的過多配對，以免形成過多的引物聚合體，造成非特異性擴增。
PCR擴增TB的特異性除上述先決條件外，也與PCR反應本身有極重要的關係.其中退火溫度是一個重要因素，退火溫度過低時，引物易發生非特異性結合，造成非特異性擴增。由於結核桿DNA中G+C含量高，因此可以適當提高退火溫度，以獲得更高的特異性。
另外，PCR緩衝液的組成，尤其是Mg2+濃度對PCR的特異性也有較大影響，Mg2+濃度過高，會提高PCR產物的產量，但同時也會增加非特異性擴增。
(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以檢測出1～100fg純化的結核桿菌DNA，相當於1～20個結核桿菌，這種敏感性明顯高於塗片法和培養法。PCR還可以檢出培養法易發生失敗的病例，從而大大提高菌陰結核病的診斷.另外PCR檢測TBDNA不受抗癆治療的影響，可以準確觀察抗癆治療的效果，防止血清學方法所帶來的假陰性結果.PCR敏感性受下列因素影響：①擴增靶序列的拷貝數，一般認為，結核桿菌染色體中含靶序列拷貝數越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在結核桿菌染色體中只有一個，而IS6110序列的拷貝數卻有10～12個，結果PCR敏感性後者比前者高100倍，②PCR的循環次數，在一定程度上，PCR循環次數越多，其敏感性就越高，但要合適.因為，循環次數過多會增加非特異性問題，造成結果判斷上的失誤，產生假陽性結果，③結核桿菌DNA的提取技術.處理標本時首先要富集(如離心)標本中的TB，使單位體積內TB含量變高，從而增加了起始模板數，有利於提高PCR的靈敏性.同時提取過程要儘可能減少抑制成份，並提高DNA的提取率.④PCR產物的檢測方法.雖然DNA探針雜交要比直接電泳法敏感性高得多，但步驟繁瑣，這也是影響PCR臨床套用的原因之一.但一般情況下，直接電泳法的敏感性完全能夠達到檢測的需要。
五.PCR在結核病臨床診斷中的套用
PCR檢測結核桿菌的優點決定了它在臨床上的套用價值和範圍，PCR檢測TB的優點主要表現如下：
1.能早期診斷TB菌血症：在TB感染的早期，特別是在TB病灶通過血源性外傳播時、及在外周血中存在極少量的TB時，PCR就能給於擴增並確診。此外，由於外周血中TB的含量甚微，又沒有新的病灶形成，因而血清學方法和物理方法均難以達到確診的目的，而對這類病灶的早期診斷在臨床治療上具有指導意義，因為早期菌血症是較易控制的，並可以防止繼發性TB病灶的形成。
2.時間短：PCR檢測TB僅需2-4h對於某些培養法難以實施的病例，PCR法則行之有效，同時提高了敏感性和特異性，可以檢測到1個TB菌。
3.有利於鑑別診斷:對於肺結核來說，其中的結核球和成人型原發性結核等，經常易於同肺癌的診斷相混淆.病灶中心部位經常出現既未見TB又未見癌細胞的壞死區.此時塗片檢測常是陰性的.在這種情況下，PCR檢測就顯得特別有效.它不但可以擴增能著色的活菌，還可以擴增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，從而確定這樣的病灶是惡性還是良性.在許多情況下，TB可以導致腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎等。塗片法儘管在診斷上具有直接、簡便的優點，但敏感性差就局限了它的診斷範圍和實用價值。PCR檢測這類標本，可以說極其有效。其極高的特異性和敏感性可以很容易地確定TB性腦膜炎及TB性胸腹水，另外，對於腎結核、泌尿生殖系統結核的診斷，PCR都可以予以完成。
4.抗癆治療的評價：對於抗癆治療效果的評價，以前的方法顯得軟弱無力。而PCR法則可以通過定期檢測，採用定量PCR法確切地評價抗癆藥物的療效及殘存菌的數量和活性度。在體內一般情況下，細菌死後，其蛋白系統很快崩潰，而DNA則能相對較長時間地保存下來，這些DNA在某種情況下又會復活。所以，細胞的死亡最可靠的評價指標是其基因DNA的完全降解，特別是在許多問題未搞清楚以前，更應該以DNA的降解來判定病原體的死與活，從理論上講，PCR擴增結果將是最可靠的療效評價指標。
5.修正以往所謂“正確”的觀念：致病菌與機體的防禦系統是一對激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打擊人體的防禦系統，以便其生存和繁殖，在健康人群和周圍環境中都攜帶或存在有大量的TB，但何時何地才會造成機體致病呢?以往認為TB很少存在於外周血，這主要是因為外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺組織中.但很難讓人相信的是，肺部血管極其豐富，淋巴組織和血管網共同構成人體的細胞外液貯存和交換的場所.所以，二者之間的交換是經常的.這種交換就包括能透過毛細血管壁的致病菌.當然，對於TB來講，大多數細菌將被機體的免疫器官禁固起來.但仍有不少“漏網之魚”，只是以前所用的方法敏感性及特異性均不夠。但在某些情況下，如情緒低落、過度勞累、感冒等情況下，機體防禦系統功能減弱，就會造成致病菌的攻擊發生疾病。所以PCR技術對於評估臨床療效、疫情的檢控、發病機理的探討均有十分重要的意義。
六、PCR在檢測TB中的注意事項
PCR如操作不嚴格會出現假陽性和假陰性結果。
發生假陽性最常見的原因是:樣品間的污染和擴增產物的污染，樣品間的交叉污染最易發生在樣品的處理過程之中。如大家共用一個加樣器、剪刀、位置等，因此在處理活檢標本時，用剪刀剪碎組織塊，每個標本用後，剪刀應在火上燒數分鐘，以徹底清除污染在剪刀上的DNA.對於液態標本的處理，儘可能在同一管子內處理.用具應為一次性的.要解決好擴增物的污染，最佳的方式是減少操作的時間，簡化操作手續並使用一次性離心管及接頭，因為擴增產物的量一般很高，易於污染實驗室任何地方.所以減少打開反應管的次數會降低假陽性的發生率。
PCR技術套用
PCR技術套用一：診斷單基因疾病
PCR技術套用二：骨腫瘤診斷
PCR技術套用三：突變基因檢測
PCR技術套用四：遺傳病診斷
PCR技術套用五：苯酶同尿症診斷
PCR技術套用六：血友病A基因診斷
PCR技術套用七：地中海貧血
PCR技術套用八：DMS/BMD基因診斷
PCR技術套用九：檢測人COX病毒
