隨著近代免疫技術與檢測方法的不斷發展，以核酸檢測為代表的分子生物學技術取得了長足進步並獲得了廣泛認可。由於其具有靈敏度高、漏檢率低、可縮短視窗期檢測時間並可監測病毒變異等優點，因而成為臨床病原體感染診斷方法的優選。在病毒研究方面，運用分子生物學檢測技術，可對病毒基因組的結構與功能、複製與表達、與宿主相互作用等進行研究，可為病毒的致病機理、疫苗研發和抗病毒藥物研製等方面提供基礎。臨床常用的檢測方法多為核酸檢測和蛋白檢測。
基本介紹
- 中文名：病毒分子生物學檢測
- 臨床意義：可為疾病的預防預測診斷提供依據
樣本要求,檢測技術,臨床意義,
樣本要求
1.常用於基因診斷的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝的全血或骨髓、血清或血漿、痰液、腦脊液、尿液以及分泌物等。採樣容器最好是密閉的一次性的，如真空採血管。一次性塑膠容器使用時無需進一步預處理。當使用非密閉採樣系統時，如尿液、分泌物和骨髓的採樣，必須注意防止來自採樣者的皮屑或分泌物的污染。採樣者採樣時應戴一次性手套。可重複使用的玻璃器皿應經高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶，故應高溫滅菌，250℃烘烤4小時以上以使RNA酶永久失活。
2.全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。通常EDTA和枸櫞酸鈉是首選的抗凝劑，但高濃度的EDTA對基因擴增有抑制作用。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其後的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用於RNA（如HCV RNA）測定的血標本最好進行抗凝處理，並儘快（3小時以內）分離血漿，以避免RNA的降解，如未作抗凝處理，則抽血後必須在1小時內分離血清。
2.全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。通常EDTA和枸櫞酸鈉是首選的抗凝劑，但高濃度的EDTA對基因擴增有抑制作用。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其後的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用於RNA（如HCV RNA）測定的血標本最好進行抗凝處理，並儘快（3小時以內）分離血漿，以避免RNA的降解，如未作抗凝處理，則抽血後必須在1小時內分離血清。
檢測技術
（一）核酸檢測在目前臨床實驗室病毒感染的監測、診斷、療效及預後判斷等方面發揮著越來越大的作用，是今後實驗室診斷的主要發展方向。對病毒的檢測主要分定性和定量兩類：
1．定性檢測
（1）原位雜交：運用酶或發光底物作為標記探針，通過原位雜交的方法直接檢測樣本中的病毒核酸，由於其缺少PCR中擴增這一環節，其敏感型低於PCR檢測，目前運用較少。
（2）聚合酶鏈式反應（PCR）：聚合酶鏈式反應是利用DNA在高溫時可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈的原理，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，可看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。由於其特異性強、靈敏度高、快速準確等優點在臨床上得到廣泛套用。
（3）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）：RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的套用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，與PCR相比多了逆轉錄的過程，臨床主要運用於RNA病毒檢測，也可用於基因表達、轉錄水平等檢測。
2.定量檢測
（1）實時定量螢光聚合酶鏈反應（Real-time PCR）：以螢光探針或螢光染料發出的螢光信號作為核酸擴增反應中的檢測指標，對循環後產物總量進行計算的技術。除可檢測病毒載量外，可用於病毒變異、耐藥等監測，是評估疾病病程、治療是否有效及預後的常用方法。其敏感性、特異性和重複性都較好。
（2）bDNA：不依賴PCR擴增的核酸雜交信號放大檢測技術，不需抽提純化RNA，不需反轉錄，不需PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解後，經探針雜交與信號放大後即可迅速得到基因定量結果。具有高靈敏度、檢測範圍大和準確定量等優點，除檢測病毒核酸外，也可檢測宿主細胞內與病毒發生相互作用基因的表達水平，具有較好的運用前景。
（3）NASBA：依賴核酸序列的擴增技術，由一對特異的引物介導的、三種酶催化的以單鏈RNA為模板的恆溫擴增技術，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、不易被污染等優點，已廣泛套用於病毒、細菌、黴菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測，特別是用於HIV、HCV等RNA病毒的檢測當中。
（4）TMA：是一種利用RNA聚合酶和逆轉錄酶在約42℃等溫反應條件下來擴增RNA或DNA的系統。技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，是比較敏感的核酸擴增技術，其檢測比較簡便，適合高通量篩選，可運用於人類白細胞抗原等位基因分型、細菌和病毒的快速檢測。
（5）LCR：是基於靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連線的一種探針擴增技術，其擴增效率與PCR相當，由於有很高的信噪比，其敏感性也很高。該技術既可擴增，又可檢測DNA突變，具有很好的運用前景。
（6）基因晶片：基因晶片又稱DNA晶片(DNA chip )或DNA微陣列(DNA microarray)。其原理是採用光導原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定於經過相應處理的矽片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然後加入標記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息。在基因表達分析、新基因發現和疾病診斷方面有越來越高的運用前景。
（二）蛋白檢測
1 免疫印跡：主要取決於抗原抗體的特異性，該方法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的技術，既具有凝膠電泳的高解析度又具備固相免疫測定的高特異性和高靈敏性，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種最常用的方法。
2 免疫螢光：將不影響抗原抗體活性的螢光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合後，在螢光顯微鏡下呈現一種特異性螢光反應，該方法特異性強、敏感性高、速度快，但對實驗室人員技術要求較高。
1．定性檢測
（1）原位雜交：運用酶或發光底物作為標記探針，通過原位雜交的方法直接檢測樣本中的病毒核酸，由於其缺少PCR中擴增這一環節，其敏感型低於PCR檢測，目前運用較少。
（2）聚合酶鏈式反應（PCR）：聚合酶鏈式反應是利用DNA在高溫時可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈的原理，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，可看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。由於其特異性強、靈敏度高、快速準確等優點在臨床上得到廣泛套用。
（3）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）：RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的套用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，與PCR相比多了逆轉錄的過程，臨床主要運用於RNA病毒檢測，也可用於基因表達、轉錄水平等檢測。
2.定量檢測
（1）實時定量螢光聚合酶鏈反應（Real-time PCR）：以螢光探針或螢光染料發出的螢光信號作為核酸擴增反應中的檢測指標，對循環後產物總量進行計算的技術。除可檢測病毒載量外，可用於病毒變異、耐藥等監測，是評估疾病病程、治療是否有效及預後的常用方法。其敏感性、特異性和重複性都較好。
（2）bDNA：不依賴PCR擴增的核酸雜交信號放大檢測技術，不需抽提純化RNA，不需反轉錄，不需PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解後，經探針雜交與信號放大後即可迅速得到基因定量結果。具有高靈敏度、檢測範圍大和準確定量等優點，除檢測病毒核酸外，也可檢測宿主細胞內與病毒發生相互作用基因的表達水平，具有較好的運用前景。
（3）NASBA：依賴核酸序列的擴增技術，由一對特異的引物介導的、三種酶催化的以單鏈RNA為模板的恆溫擴增技術，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、不易被污染等優點，已廣泛套用於病毒、細菌、黴菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測，特別是用於HIV、HCV等RNA病毒的檢測當中。
（4）TMA：是一種利用RNA聚合酶和逆轉錄酶在約42℃等溫反應條件下來擴增RNA或DNA的系統。技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，是比較敏感的核酸擴增技術，其檢測比較簡便，適合高通量篩選，可運用於人類白細胞抗原等位基因分型、細菌和病毒的快速檢測。
（5）LCR：是基於靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連線的一種探針擴增技術，其擴增效率與PCR相當，由於有很高的信噪比，其敏感性也很高。該技術既可擴增，又可檢測DNA突變，具有很好的運用前景。
（6）基因晶片：基因晶片又稱DNA晶片(DNA chip )或DNA微陣列(DNA microarray)。其原理是採用光導原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定於經過相應處理的矽片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然後加入標記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息。在基因表達分析、新基因發現和疾病診斷方面有越來越高的運用前景。
（二）蛋白檢測
1 免疫印跡：主要取決於抗原抗體的特異性，該方法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的技術，既具有凝膠電泳的高解析度又具備固相免疫測定的高特異性和高靈敏性，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種最常用的方法。
2 免疫螢光：將不影響抗原抗體活性的螢光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合後，在螢光顯微鏡下呈現一種特異性螢光反應，該方法特異性強、敏感性高、速度快，但對實驗室人員技術要求較高。
臨床意義
分子生物學是利用分子、蛋白的檢測技術和方法研究人體內源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結構或表達調控的變化，運用於臨床可為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供信息和決策依據。近些年其發展迅速，並滲透到了多門學科的研究領域。分子生物學在對疾病的診斷、預防和治療方面正在發揮日益重要的作用，並將成為推動醫學檢驗發展的主要力量。
