流行性感冒病毒核酸檢測試劑註冊申報資料指導原則

《流行性感冒病毒核酸檢測試劑註冊申報資料指導原則》是對流感病毒核酸檢測試劑的一般要求。

一、前言

本指導原則旨在指導註冊申請人對流行性感冒病毒（以下簡稱流感病毒）核酸檢測試劑註冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對註冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對流感病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，並依據產品的具體特性對註冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性檔案，但不包括註冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以採用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

二、適用範圍

流感病毒核酸檢測試劑是指利用螢光探針聚合酶鏈式反應（PCR）或其他類分子生物學方法，以特定的流感病毒基因序列為檢測目標，對人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物樣本中的流感病毒進行體外定性檢測的試劑。

本指導原則適用於進行首次註冊申報和相關許可事項變更的產品。

三、註冊申報資料要求

（一）綜述資料

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型極少引起流行。依據病毒顆粒外膜血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分為16個H亞型（H1-H16）和9個N亞型（N1-N9），目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亞型有人感染的報導。由於編碼HA和（或）NA的核苷酸序列容易發生突變，致使HA和（或）NA的抗原表位發生改變，這種抗原性的改變使人群原有的特異性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起較大規模甚至世界性的流感流行。按照流行特點，造成人間流感流行的流感病毒可區分為季節性流感病毒和新型甲型流感病毒。季節性流感病毒通常在年度間發生小範圍的基因變異，這種基因變異會導致微小的抗原性改變，稱為抗原漂移（antigenic drift）。因此，季節性流感病毒雖具有年度特異性且抗原性的改變使感染者不易獲得持久免疫力，但傳播範圍通常局限於較小的人群範圍，一般不會造成太高的發病率和死亡率，易感人群多為老年人（>65歲）和嬰幼兒（<6歲）。在過去的幾十年中，季節性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亞型。近年來，新型甲型流感病毒亞型暴發流行的案例時有發生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亞型）病毒的病例時有報導，禽類甲型H5N1亞型流感病毒被認為具有造成人間大範圍流感流行的潛力。新型甲型流感病毒通常由於基因的節段性重組所致，這種大範圍的基因改變易導致病毒抗原特性的重大改變，稱為抗原轉變（antigenic shift）。新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同時包含了禽流感、豬流感和人季節性流感的基因片段從而導致病毒在抗原水平發生了明顯改變。由於抗原性的明顯改變以及可能由此造成的病毒毒力的增強，病毒的傳染性和致病嚴重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的發病率和死亡率。

流感病毒主要經空氣飛沫傳播，常引起發熱、乏力、肌肉酸痛以及輕到中度的呼吸道症狀，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸檢測試劑可用於流感的輔助診斷，甲型流感病毒各亞型檢測試劑還可用於區分季節性流感病毒和新型甲型流感病毒，並可獲得關於流感暴發的流行病學信息。

用於流感病毒檢測的樣本採集無法標準化，且具有一定的隨意性，利用核酸定量檢測的方法對流感病人進行病情監測或療效觀察，並無合理的臨床指導意義，甚至可能導致錯誤的醫學解釋，誤導用藥量的增減或其他診療措施，因此，不建議企業研發流感病毒核酸的定量檢測試劑。

在註冊申報資料中，流感病毒的命名應採用世界衛生組織關於流感病毒毒株命名的相關要求進行。流感病毒毒株命名包括6個要素：型別/宿主/分離地區/毒株序號/分離年份（Hn和Nn），H和N分別代表血凝素和神經氨酸酶，n是阿拉伯數字，對於人流感病毒可以省略宿主信息。如名為“A/Shanghai/37T/2009（H1N1）”的病毒株代表2009年在上海分離的以人為宿主的甲型H1N1亞型流感病毒，毒株序號為37T。

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學及不同類型毒株檢出能力等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批准的同類產品之間的主要區別。應符合《體外診斷試劑註冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑註冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關要求。

（二）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、標本採集及處理、實驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑註冊申報最重要的檔案之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應儘量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的註冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規範格式對此內容進行標註，並單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對流感病毒核酸檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導註冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

（1）試劑盒用於定性檢測人鼻咽拭子、口咽拭子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其他呼吸道分泌物樣本的流感病毒核酸，適用樣本類型應結合實際的臨床研究完成情況進行確認。

（2）簡單介紹待測目標的特徵，如病毒種系淵源、生物學性狀、宿主特性、致病性、感染後臨床表現、待測靶基因特徵等。

（3）待測人群特徵介紹：具有流感樣症狀的患者、相關的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等。

（4）強調：實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程式。

2.【主要組成成份】

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質控品）可能含有人源組分，應提供其生物學來源、活性及其他特性；不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

（2）試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

（3）如果試劑盒中不包含用於核酸分離/純化的試劑組分，則應在此註明經驗證後推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產企業、產品名稱以及產品貨號等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩定性、開封穩定性、復融穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等。

4.【樣本要求】 重點明確以下內容：

（1）樣本採集時間點的選擇：是否受臨床症狀、用藥情況等因素的影響。

（2）對採樣拭子、容器及保存液的要求：對採樣拭子的材質要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器、轉運保存液的要求、轉運條件等。

（3）樣本採集：具體採集部位及類型，詳述具體的操作方法或列出相關操作指南檔案以指導使用者（最好能夠給出具體圖示），儘量減少由於樣本採集或處理不當對實驗造成的影響。

（4）樣本處理及保存：核酸提取前的預處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復室溫，凍融次數限制。

5.【適用機型】所有適用的儀器型號，並提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【檢驗方法】 詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

（1）實驗條件：實驗室分區、實驗環境的溫度、濕度、空調氣流方向控制等注意事項。

（2）試劑配製方法、注意事項。

（3）詳述待測樣本及相關對照品（質控品）核酸提取的條件、步驟及注意事項。

（4）核酸提取方法的詳細介紹。

（5）擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

（6）RT-PCR各階段的溫度、時間設定、循環數設定及相關注意事項。

（7）儀器設定：特殊參數、結合探針的螢光素標記情況對待測基因及內標的螢光通道選擇。

（8）基線、循環閾值（Ct值）的選擇方法。

7.【檢驗結果的解釋】

結合陽性對照、陰性對照、內對照（內標）以及樣本管靶基因檢測結果的Ct值，以列表的形式對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區，應對灰區結果的處理方式一併詳述。另外，如果PCR體系中包含了兩個或以上的螢光探針對靶基因序列進行檢測，則在結果解釋時，應對每個探針所對應螢光通道的Ct值的結果及可能產生的結果組合均進行合理解釋。說明對何種條件下需要進行重複檢測以及在重複檢測時對待測樣本可能採取的最佳化條件等進行詳述。

8.【檢驗方法局限性】

（1）本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其症狀/體徵、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

（2）有關假陰性結果的可能性分析

①不合理的樣本採集、轉運及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導致假陰性結果。

②流感病毒待測靶序列的變異或其他原因導致的序列改變可能會導致假陰性結果。

③對於突發的新型甲型流感病毒，其檢測的最適樣本類型及感染後的最佳採樣時間可能尚未確認，因此，在同一患者分次、多部位採集樣本會降低假陰性結果的可能性。

④未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子，如……等可能會導致假陰性結果（如有）。

9.【產品性能指標】 詳述以下性能指標：

（1）對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。對於甲型流感通用型核酸檢測試劑，應列出所有驗證過的甲型各亞型病毒株的信息。

（2）最低檢測限（分析靈敏度）：說明試劑的最低檢出濃度，建議採用生物學方式表示病毒滴度，如半數組織培養感染量（TCID50）或空斑形成單位（PFU）的形式，簡單介紹最低檢測限的確定方法以及對最低檢測限驗證所採用的病毒株信息。

（3）企業內部陽性/陰性參考品符合率，簡單介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品組成、來源以及濃度梯度設定等信息。

（4）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準。

（5）分析特異性

①甲型流感病毒各亞型間的交叉反應驗證：針對甲型流感病毒亞型檢測的試劑盒，則應對較常見的除目的基因外的其他亞型進行交叉反應驗證並對結果進行合理分析；

②交叉反應：易產生交叉反應的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經過交叉反應驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息；

③干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如血液、粘蛋白、膿液等；

④藥物影響：治療感冒或其他呼吸道症狀患者外用或內服的常見藥物對檢測結果的影響，如常見抗感冒藥物、糖皮質激素、抗生素、中藥等。

（6）對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所採用的統計學方法及統計分析結果。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

（1）有關人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內對照品（質控品）或其他可能含有人源物質的組分，雖已經通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）實驗室管理應嚴格按照國家有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規範執行。實驗人員必須進行專業培訓；實驗過程應分區進行（試劑準備區、樣本製備區、擴增和產物分析區），實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不得交叉使用；各區間人員流動及空氣流向應有嚴格要求，最大限度避免交叉污染；實驗用消耗品（如離心管、吸頭等）應有合理的清潔和質檢程式，避免RNA酶污染或擴增反應抑制物造成假陰性結果。

（三）擬定產品標準及編制說明

擬定產品標準應符合《辦法》和《體外診斷試劑註冊申報資料基本要求》的相關規定。另外，對於國產試劑，應參考《中國生物製品規程》（2000年版），將擬申報產品的主要原材料、生產工藝及半成品檢定等內容作為附錄附於標準正文後，並在正文的“產品分類”項中引出該附錄內容。附錄中應將待測靶基因的基因位點、全序列，引物/探針序列、來源及驗證情況，各種酶的來源、特性以及驗證等重點內容予以明確。

流感病毒核酸檢測試劑的註冊檢測應主要包括以下性能指標：物理性狀、試劑盒內陰性/陽性對照品（質控品）的Ct值要求（包括內標）、陽性/陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。陽性參考品主要考察對不同來源的病毒株、不同滴度的檢測符合性，對於甲型流感病毒核酸通用型檢測試劑，在此還應考慮不同亞型的覆蓋檢測能力。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反應）的驗證，應主要包括易發生交叉反應的其他病原體的假陽性情況的考核。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低於上述標準要求。

（四）註冊檢測

根據《辦法》要求，首次申請註冊的第三類產品應該在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢範圍的醫療器械檢測機構進行連續3個生產批次樣品的註冊檢測。對於已經有國家標準品的流感病毒項目，在註冊檢測時應採用相應的國家標準品進行,對於目前尚無國家標準品的項目，生產企業應建立自己的參考品體系並提供相應的內部參考品。

（五）主要原材料研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品或標準品的選擇與來源、製備過程、質量分析和質控標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料購自其他供貨商，應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關資料、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨後的質量檢驗資料。

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

2.RT-PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、製備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

（1）脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩定性等驗證資料。

（2）引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常採用DNA合成儀人工合成，合成後經聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對序列準確性、純度、穩定性、功能性實驗等驗證資料。如為外購，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3）探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用於特定核酸序列的探測。合成後經聚丙烯醯胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進行標記，並經HPLC或其他適宜方法純化。純度應達到HPLC純，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明。

（4）PCR反應所需酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性，如：94℃保溫1小時後仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，應對酶活性有合理驗證；逆轉錄酶，具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。應提供有關保存穩定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

3.對照品（質控品）的原料選擇、製備、定值過程及試驗資料。

4.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無DNase和RNase污染。

（六）主要生產工藝及反應體系的研究資料

基本生產工藝主要包括：配製工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配製工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配製過程應對pH、電導率等關鍵參數進行有效控制。

生產工藝研究資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應條件、質控體系設定、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據，主要包括以下內容：

1.主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。

3.基因位點選擇、RT-PCR方法學特性介紹。

4.確定最佳RT-PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5.確定RT-PCR反應各階段溫度、時間及循環數的研究資料。

6.對於基線閾值（threshold）和閾值循環數（Ct）確定的研究資料。

7.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

另外，對於試劑盒的對照（質控）品設定，建議企業參考以下要求執行：

（1）流感病毒核酸檢測試劑盒的外部對照（質控）品應至少設定臨界陽性對照（質控）品和陰性對照（質控）品，均應參與樣本核酸的平行提取，以對核酸提取、RT-PCR反應過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制，企業應對各種對照（質控）品的Ct值做出明確的範圍要求。注意，建議採用與實際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質溶液作為陰性對照（質控）品，不推薦採用水作為陰性對照（質控）品。

（2）樣本反應管應設定合理的內對照（內標）以對管內抑制可能造成的假陰性結果進行質控。申請人應對內標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內標螢光通道呈明顯的陽性曲線又要儘量降低對靶基因檢測造成的競爭性抑制而導致假陰性。對內標的Ct值也應有明確的範圍要求。

（3）關於對照品的原料選擇：內對照（內標）應採用具有蛋白外殼的病毒顆粒，如滅活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒）等，外部陽性對照可以採用滅活病毒、假病毒或質粒。

（七）分析性能評估資料

企業應提交原廠在產品研製階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、實驗數據、統計分析等詳細資訊。對於流感病毒核酸類定性檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.流感病毒核酸（RNA）提取

病毒RNA提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定RT-PCR成敗的要素之一。RNA極易受RNA酶（RNase）的降解，而臨床標本和實驗室環境中存在大量的RNase，因此，無論申報產品是否含有RNA分離/純化的組分，企業都應對核酸提取的環節做充分的驗證。除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化步驟，儘可能去除PCR抑制物。傳統的RNA分離純化方法（如表面活性劑加蛋白酶結合氯仿-酚抽提法）和改良方法（如矽磁性微粒吸附法）均有或多或少的優勢和不足，申請人應結合申報產品的特性，合理選擇RNA分離/純化試劑，並提供詳細的驗證資料。

2.最低檢測限（分析靈敏度）

（1）最低檢測限的確定

建議使用培養後病毒原液的梯度稀釋液進行最低檢測限確定，每個梯度的病毒稀釋液重複3～5份，每份進行不少於20次的重複檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限。通過另製備至少5份最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對90%～95%的檢出率進行確認。建議採用半數組織培養感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）、空斑形成單位（plaque forming units，PFU）法或copies/ml的方式進行病毒濃度確認，並採用上述方式作為病毒濃度的表示方式。在進行最低檢測限的確認時，參與研究的甲型流感病毒各亞型和乙型流感病毒應至少包括不同來源的兩個具有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。

（2）最低檢測限的驗證

申報試劑應在最低檢測限或接近最低檢測限的病毒濃度對每種常見待測流感病毒亞型具有時間和區域特徵性的至少3個病毒株進行驗證。對此，企業應能夠提供用於最低檢測限驗證的各個病毒株的來源、型別確認及滴度確認試驗等信息。用於最低檢測限確定和驗證的病毒株如包括疫苗株，則其應能夠體現最近流感發病季的病毒特點。

3.分析特異性

（1）交叉反應

①用於流感病毒核酸檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床症狀、採樣部位正常寄生或易並發的其他微生物。

②建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。

③首先，應在流感病毒不同型別和亞型間進行交叉反應驗證；其次，採用其他的病原微生物進行驗證（見表1）。

④申請人應提供所有用於交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。

表1 建議用於交叉反應性研究的微生物

*項：選擇性驗證。

（2）干擾物質

①潛在的干擾物質主要包括：血液、鼻分泌物或粘液、用於緩解鼻塞和咽部充血、鼻腔乾燥、刺激、哮喘和過敏症狀的藥物（見表2）。

②使用醫學相關水平的干擾物濃度進行驗證，另外，建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價。

③申請人應採用每種流感病毒亞型的至少兩種病毒株對呼吸道樣本中物質的潛在抑制影響進行評估，建議在每種流感病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質的干擾影響進行檢測。

表2 建議用於干擾研究的物質

4.精密度

測量精密度的評價方法並無統一的標準可依，可根據不同產品特徵或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考相關的CLSI-EP檔案或國內有關體外診斷產品性能評估的檔案進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異係數的範圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變數進行驗證，除申報試劑（包括提取組分和RT-PCR組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少於2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重複實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用於精密度評價的質控品應至少包括3個水平:

①陰性質控品：待測物濃度低於最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

②臨界陽性質控品：待測物濃度略高於試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應高於95%（n≥20）。

③陽性質控品：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

另外，建議申請人選擇適量臨床採集的新鮮病人樣本（包括所有樣本類型）作為無靶值質控品進行精密度評價，以更好地模仿臨床檢測環境。

5.陽性/陰性參考品

如申報產品有相應的國家參考品，則企業內部陽性/陰性參考品應參考國家參考品的項目設定。在不低於國家參考品要求的前提下，申請人可以結合實際情況設定合理的企業內部陽性/陰性參考品。對於沒有國家參考品的產品，申請人應根據產品性能驗證的實際情況自行設定企業內部參考品，陽性參考品應著重考慮病毒型別、亞型及滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應）的驗證情況。

申請人應對內部陽性/陰性參考品的來源、型別鑑定、病毒滴度等信息進行精確的實驗驗證，並提交詳細的驗證資料。

6.其他需注意問題

對於適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。

（八）參考值（參考範圍）確定資料

對於此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認資料，建議申請人採用受試者工作特徵（ROC）曲線的方式對申報產品用於結果判斷的臨界值予以確認。

（九）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對於實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期後的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業也應對樣本穩定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度範圍內選擇3～5個溫度點（應至少包括範圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。在對樣本進行效期穩定性的評價時，同時應對推薦使用的採樣拭子、樣本保存液及保存容器進行合理驗證。適於冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（十）臨床試驗研究

1.研究方法

對於已有同類產品上市的試劑的臨床研究，選擇境內已批准上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，採用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優於已上市產品。另外，申請人還應選擇一定數量的新鮮採集樣本進行考核試劑與流感病毒檢測的“金標準”方法—病毒分離培養鑑定方法的比較研究，每種樣本類型不少於30例經病毒分離培養方法確定為陽性的樣本。

對於無法選擇參比試劑的新型流感病毒核酸檢測試劑，其臨床研究應選擇病毒分離培養鑑定和/或病毒核酸序列測定方法作為參比方法，總例數不少於500例。用於核酸序列測定的引物序列應不同於考核試劑中用於檢測目的基因的引物序列。

另外，對於已被批准上市的甲型流感病毒核酸（通用型）檢測試劑，如果在其註冊證有效期內出現了新型甲型流感病毒的暴發流行，如有需要，生產企業應迅速針對新的流感亞型開展臨床比對研究，可以採用病毒檢測的“金標準”方法或當時衛生行政部門認可的針對該新型甲型流感病毒亞型的診斷標準作為參比方法進行臨床比對研究，分別對採集自新型甲型流感病毒感染（陽性病例不少於30例）、其他常見的流感病毒亞型（如當年流行的季節性甲型流感病毒）以及非流感病毒感染但具有流感樣症狀的患者的新鮮樣本進行比對實驗研究，總例數不少於100例，如臨床試驗研究結果可以證明其對新型甲型流感病毒亞型的檢測能力，申請人在重新註冊時應考慮到因病毒株變化而導致預期用途發生實際改變的因素，同時提出變更申請，並按相關法規要求提交分析性能評估和臨床試驗研究等資料。

2.臨床研究單位的選擇

考慮到流感病毒不同病毒株的區域性特徵較強，故建議申請人在國內不同區域選擇臨床單位，儘量使各單位的臨床樣本有一定的區域代表性；臨床研究單位應具有呼吸道疾患診療和分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程式等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應處於有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重複性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設定應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內並由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案並明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應採用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機型應完全一致，以便進行合理的統計學分析。另外，考核試劑的樣本類型不應超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應選擇病毒分離培養鑑定或其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應選擇具有流感症狀/體徵（例如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發燒、頭疼、肌痛）、流感相似症狀或有密切接觸史的人群作為研究對象。患者流感症狀出現後，流感病毒在鼻腔或氣管分泌物中的濃度在24～48小時內將保持較高水平，但在不同年齡段人群可能有一定差異，在兒童體內的持續時間更長。申請人在建立病例納入標準時，應考慮到各年齡段人群的差異，儘量覆蓋各個年齡段人群。在進行結果統計分析時，除總體病例數的要求外，建議對各年齡段人群分層進行數據統計分析 。

對於新型甲型流感病毒亞型核酸檢測試劑，如新型甲型流感病毒（2009流行株）、高致病性禽流感病毒H5亞型等，其臨床研究所選擇病例除新型甲型流感病毒感染者及密切接觸者外，還應包括其他當年流行的季節性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但具有流感樣症狀的患者等。其臨床研究應能夠體現該產品對新型甲型流感病毒核酸檢測的特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應為實際臨床檢測中常用的樣本類型。通常，我們建議對於每種樣本類型應有不少於100例的陽性病例，對於陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、受試者工作特徵（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對於本類產品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對於兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應採用“金標準”方法或臨床上普遍認為質量較好的第三種同類試劑進行覆核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。

7.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，並應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統計學方法、統計軟體、評價統計結果的標準。

（2）具體的臨床試驗情況

①申報試劑和參比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

②對各研究單位的病例數、年齡分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

③質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

④具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本長期保存、結果不一致樣本的校驗等。

（3）統計學分析

①數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區間。

③以交叉表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。

另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

（4）討論和結論

對總體結果進行總結性描述並簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最後得出臨床試驗結論。

四、名詞解釋

1.分析特異性（Analytical Specificity）：測量程式只測量被測量物的能力。分析特異性用於描述檢測程式在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，並給出在特定醫學相關濃度值水平的分析干擾程度。

註：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物。

2.精密度（Precision）：在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異係數（CV）。

五、參考文獻

1.《體外診斷試劑註冊管理辦法（試行）》，（國食藥監械〔2007〕229號），2007年4月19日

2.《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》，（國食藥監械〔2007〕240號），2007年4月28日

3.《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》，（國食藥監械〔2007〕240號），2007年4月28日

4.Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of Influenza Viruses, CDRH, FDA, USA, February 15, 2008

5.彭文偉，《傳染病學》，第五版，人民衛生出版社，2001。

6.李金明，《實時螢光PCR技術》，第一版，人民軍醫出版社，2007

7.Robert F. Weaver， Molecular Biology，4th Edition，2008。

8.劉艷芳、張勇建、蘇明，臨床病毒學檢驗，軍事醫學科學出版社，2009。

9.Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute （Formerly NCCLS）, MM3-A2, Vol26 No.8, ISBN 1-56238-596-8.

10.Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 No.28. ISBN 1-56238-508-9.

11.Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute （Formerly NCCLS）, MM17-A, Vol.28 No.9, ISBN 1-56238-661-1.

12.馮仁豐，《臨床檢驗質量管理技術基礎》，第二版，上海科學技術文獻出版社，2007年4月。

13.《中國生物製品規程》（2000年版），化學工業出版社