原核表達

廣義的原核表達，是指發生在原核生物內的基因表達。狹義的原核表達，常出現於生物工程中。是指通過基因克隆技術，將外源目的基因，通過構建表達載體並導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內表達。

基本介紹

• 中文名：原核表達
• 意思：發生在原核生物內的基因表達
• 狹義原核表達：常出現於生物工程中
• 通過：基因克隆技術

原核表達系統

一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統或者Tag檢測等等。選擇表達系統通常要根據實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產物的純化方法等等。

1.1 表達載體

為了獲得高水平的基因表達產物，人們通過綜合考慮控制轉錄、翻譯、蛋白質穩定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，設計出了許多具有不同特點的表達載體，以滿足表達不同性質、不同要求的目的基因的需要。

通常關心的表達載體質粒上的元件包括：啟動子、多克隆位點、終止密碼、融合Tag（如果有的話）、複製子、篩選標記或報告基因等。

複製子

通常表達載體都會選用高拷貝的複製子。pSC101類質粒是嚴謹方式複製，拷貝數低，pCoE1，pMBI(pUC)類的複製子的拷貝數高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質粒拷貝數和表達量是非線性的正相關，當然也不是越多越好，超過細胞的承受範圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質粒共轉化，就要考慮複製元是否相容的問題。

篩選標記和報告基因

氨苄青黴素抗性是最常見的篩選標記，卡那黴素或者是新黴素次之，通常是另一個載體的篩選標記用。四環素，紅黴素和氯黴素等已經日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會對研究對象產生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問題應該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導致抗生素失效。對於做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關心或者用到報告基因吧。綠色螢光蛋白是最常用的報告基因了。其他還有半乳糖苷酶、螢光素酶等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

啟動子

啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉錄模式上看有組成型表達和誘導調控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。

終止子

轉錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用，即控制轉錄的RNA長度提高穩定性，避免質粒上異常表達導致質粒穩定性下降。放在啟動子上游的轉錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉錄終止mRNA和根據模版上的對稱序列形成髮夾結構而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉錄終止子。

核糖體結合位點

啟動子下游從轉錄起始位點開始延伸的一段鹼基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始複合物是必需的，多數載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有。

1.2 表達菌株

表達菌株是我們往往最容易忽視的一點。目前絕大多數重要的目的基因都是在大腸桿菌中表達的。不同的表達載體對應有不同的表達菌株，一些特別設計的菌株更有助於解決一些表達難題。