CD33是髓系細胞分化抗原,分子量為67KD,主要分布在髓系血細胞,特別是在分化的早期階段。
基本介紹
- 中文名:CD33
- 分子量:67KD
- 分布:髓系血細胞
- 含義:髓系細胞分化抗原
定義,特點,增強抗腫瘤免疫,基本原理,研究目的,方法,結論,
定義
其胞內區含有免疫酪氨酸抑制基序(ITIM),所以它可能具有通過募集信號分子來調節細胞的生長與分化等功能。
特點
CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表達。在造血幹細胞表面沒有表達,在成熟的粒細胞和其他組織也沒有表達,因此CD33成為髓系白血病治療的良好靶點。
增強抗腫瘤免疫
基本原理
有文獻證實AML細胞表面免疫共刺激分子CD80表達低下或缺乏,是導致白血病細胞不能被機體細胞毒性T細胞(CTL)有效地識別殺傷,從而逃逸宿主免疫監視的重要原因之一,而T細胞也因缺乏第二信號而無能。因此可以利用CD33表面抗原作為AML白血病細胞的表面標記,構建CD80胞外區-抗人CD33單鏈抗體(ExCD80-CD33scFv)融合基因、表達融合蛋白,通過融合蛋白中抗人CD33scFv將CD80胞外區結合到AML白血病細胞表面,刺激腫瘤特異性CTL細胞活化,從而增強抗腫瘤免疫。
研究目的
構建及表達抗人CD33單鏈抗體(CD33scFv)基因,並檢測其生物活性;擴增CD80胞外區,構建ExCD80-CD33scFv融合基因,並在大腸桿菌中表達融合蛋白,進一步檢測融合蛋白的生物活性。
方法
HIM3-4是血研所研製的分泌鼠源性抗人CD33單克隆抗體的雜交瘤細胞,並已獲得國際人類白細胞分化抗原協作組會議正式命名。我們利用RT-PCR技術分別克隆了抗人CD33單克隆抗體HIM3-4的輕、重鏈可變區基因,並利用短肽(Gly4Ser)3作為linker,通過overlap PCR方法組裝成抗人CD33scFv。將獲得的抗體基因克隆到具有強啟動子的PET28a(+)載體上,套用IPTG誘導表達,純化的表達產物經證明具有與靶抗原人類CD33特異結合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠贈,我們通過另行設計帶所需酶切位點的引物來擴增CD80胞外區,在此基礎上,利用人血清白蛋白(HAS)第三結構域親水性的403-427位胺基酸作為鏈間連線肽將抗人CD33單鏈抗體及人類細胞表面抗原CD80胞外區基因分別經酶切、純化後克隆至原核表達載體PET22b(+)中,經IPTG誘導,在大腸桿菌內獲得了融合蛋白的表達。融合蛋白的成功構建與表達,為下一步探討血液腫瘤的免疫治療機制奠定了基礎。結果:1.通過RT-PCR方法,利用通用引物從HIM3-4雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因,分別為321bp和366bp,我們利用(GGGG)3為連線肽構建了抗人CD33基因工程單鏈抗體,並在PET28a(+)中得到表達,蛋白大小約為31KD,經復性後具有與人CD33結合活性。2克隆出CD80胞外區序列,大小為633bp。3利用大小為25Aa的鏈間連結肽,將CD80胞外區與CD33ScFv連為融合表達基因,並在PET22b(+)中得到表達,蛋白大小約為55KD,經復性後具有與人CD33抗原結合活性。
結論
- 從HIM3-4雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因,經測序為功能性重排的抗體可變區基因。
- 用(Gly4Ser)3連線肽基因將VH、VL連線成scFv基因,並用表達載體PET28a(+)表達了scFv蛋白。
- 擴增了人類ExCD80 cDNA序列,測序顯示序列正確。
- 構建了PET22b(+)-ExCD80-CD33scFv融合基因表達質粒,並在含有稀有密碼子的宿主菌Rosetta(DE3)中獲得了表達。並初步探討了其生物學功能。