雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑑定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑑定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑑定反應蛋白質單位1-10mg。

基本介紹

• 中文名：雙縮脲法
• 外文名：Biuret method
• 成分：氫氧化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉
• 用途：鑑定蛋白質

名詞解釋

雙縮脲反應產生的紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及胺基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。

雙縮脲試劑中真正起作用的是硫酸銅，而氫氧化鉀僅僅是為了提供鹼性環境，因此它可被其他鹼，如氫氧化鈉所代替。向試劑中加入碘化鉀，可延長試劑的使用壽命。

雙縮脲法

（一）實驗原理

雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連線的肽鍵，或能夠以一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及胺基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩衝液和某些胺基酸等。

此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差，不適合微量蛋白的測定。

（二）試劑與器材

1. 1. 試劑：

（1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配製成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配製，酪蛋白用0．05N NaOH配製。

（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存於塑膠瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。

1. 2. 器材：

可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1. 標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20~25℃）下放置30分鐘，於540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪製標準曲線。

2、樣品的測定：取2~3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。