細胞核內低氧誘導因子轉錄活性的調節機制研究

《細胞核內低氧誘導因子轉錄活性的調節機制研究》是依託四川大學，由丁雪琴擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：細胞核內低氧誘導因子轉錄活性的調節機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：丁雪琴
• 依託單位：四川大學

項目摘要

低氧誘導因子(HIF-1)是機體缺血缺氧時調節血管再生的核心因子。慢性心肌缺血組織中有HIF-1表達量上升但轉錄活性下降導致血管新生減少的矛盾現象。前期研究表明，HIF-1進入細胞核後銅有確保其活性的作用。進一步實驗發現缺氧時細胞核中的銅含量增加，核內的超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白(CCS)含量也增加。以CCS為切入點我們發現它對HIF-1活性的調節是通過抑制核內天冬醯胺醯羥化酶(FIH1)實現的。FIH1是調控HIF-1轉錄複合物形成的關鍵分子，利用免疫共沉澱富集與FIH 1結合的蛋白複合體，經分析發現FIH 1與銅結合蛋白有相互作用。基於上述研究，本項目將圍繞(1)CCS抑制FIH1的分子基礎是什麼(2)鑑定介導CCS與FIH1相互作用的關鍵銅結合蛋白(3)該蛋白對FIH1的調節機制是什麼三個問題深入研究細胞核內HIF-1轉錄活性的調控機制，為臨床上治療心肌缺血提供新的作用靶點和理論依據。

結題摘要

低氧誘導因子（HIF-1）是機體應對低氧反應的核心因子，調節了下游超過100個基因。在慢性缺血狀態下，心臟的HIF-1α含量仍然增高但轉錄活性下降。課題組前期研究已經證實在慢性缺血時心臟的低銅狀態與HIF-1α轉錄活性下降之間有相關性。銅是HIF-1α進入細胞核後形成轉錄複合物的必需因素。由於機體內不存在游離的銅離子,本研究項目的重點就是探索銅調節HIF-1細胞核內轉錄活性的關鍵含銅蛋白和其調節HIF-1轉錄活性的機制。 我們確認了細胞核內與HIF-1α相互作用的FIH1是銅調節HIF-1轉錄活性的關鍵蛋白。以FIH 1 為抓手，採用免疫共沉澱富集了正常生理條件和缺銅狀況下能與FIH1 結合的蛋白，並用質譜定性和非標定量的方法比較了兩種情況下能和FIH1 結合蛋白的差異。通過胺基酸序列分析篩選出與FIH1結合併具有金屬結合位點的候選因子，並選擇 ABCE1開展研究。 首先採用IMAC-Cu結合小柱富集細胞內能與銅離子結合的蛋白，以已知的含銅蛋白CCS為參照，在體外驗證了ABCE1與CCS一樣具有結合銅離子的能力。採用重組純化ABCE1蛋白通過ITC的方法確證ABCE1結合銅離子的強度。第二步我們採用轉染帶有GFP標記的ABCE1質粒，鏡下觀察ABCE1在細胞內的準確定位，以及分離細胞漿和細胞核經免疫印跡均確認ABCE1存在於細胞核中。由於沒有關於ABCE1在細胞核中的功能的詳細報導，我們沉默了ABCE1，觀察HIF-1對下游不同基因的表達情況，發現在沉默ABCE1時，HIF-1調節的下游基因BNIP3，VEGF顯著下降，而IGF2沒有變化。這種對HIF-1轉錄活性的選擇性調節與團隊發現的銅對HIF-1轉錄活性的選擇性調節一致。 本項目探索了在細胞核中參與調節HIF-1轉錄活性的潛在含銅蛋白，首次確認ABCE1具有銅離子結合特性，並發現該蛋白具有影響HIF-1轉錄活性的作用，並且這種作用與課題組已經確認的銅選擇性調節HIF-1轉錄活性的特點一致性。該工作對深入理解HIF-1轉錄活性的選擇性調節的分子機制提供了一個新的切入點。此外利用項目支撐，研究工作還擴展了細胞核中FIH1進入細胞核的機制以及含銅蛋白的蛋白組學分析方法。研究人員參加國際會議一次，發表會議論文1篇，投遞SCI論文4篇，發表1篇，接收1篇，處於修改階段2篇。