流行性感冒診斷標準及處理原則是診斷和處理流行性感冒的標準。
流行性感冒（簡稱流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要通過空氣飛沫傳播。流感病毒有甲、乙、丙三個型，其中甲型所引起的流感流行最為廣泛和嚴重，乙型常引起爆發，丙型則多引起小兒散發病型。在我國雖將該病歸屬於法定丙類傳染病，但一旦流行，傳播快、波及面廣，對人民健康及勞動生產力有很大影響，而且對年老體弱多病者及嬰幼兒的威脅較大。為貫徹執行《中華人民共和國傳染病防治法》及《中華人民共和國傳染病防治法實施辦法》，特制定本標準。
基本介紹
- 中文名：流行性感冒診斷標準及處理原則
- 類別：診斷處理原則
- 提出機構：中華人民共和國衛生部
- 起草人：陶三菊
- 起草單位：中國預防醫學科學院病毒學研究所
適用範圍,診斷原則,臨床症狀,病例分類,診斷標準,
適用範圍
本標準規定了流感的診斷標準及處理原則。
本標準適用於各級各類醫療、衛生、保健機構和人員對流感的診斷、報告和處理的套用。
診斷原則
流感流行時一般根據臨床症狀、結合流行病學可對病人作出初步診斷。如確定診斷則需要分離病毒陽性或病人雙份血清抗體，測定恢復期抗體較急性期增高4倍或以上。
臨床症狀
⒊2.1，出現急起畏寒、高熱、頭痛、頭暈、全身酸痛、乏力等中毒症狀。
⒊2.2，可伴有咽痛、乾咳、流鼻涕、流淚等呼吸道症狀。
⒊2.3，少數病例有食慾減退，伴有腹痛、腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道症狀。
⒊3，實驗室診斷
⒊3.1，血液化驗檢查白細胞總數不高或偏低。
⒊3.2，從病人鼻咽分泌物分離到流感病毒（見附錄A）。
⒊3.3，恢復期病人血清中抗流感病毒抗體滴度比急性期有4倍或4倍以上升高（見附錄B）。
⒊3.4，直接檢查呼吸道上皮細胞的流感病毒抗原陽性（見附錄C中C1）。
⒊3.5，標本經敏感細胞增殖1代後查抗原陽性（見附錄C中C2）。
病例分類
⒊4.1，疑似病例
具備3.1加3.2或3.1加3.2加3.3.1。
⒊4.2，確診病例
疑似病例加3.3.2或3.3.3或3.3.4或3.3.5。
4，處理原則
⒋1，早期隔離病人、對症治療病人和防治合併症
早期發現病人、早期隔離病人是最重要的措施。對病人治療一般採用對症治療。防治併發症主要應防止流感病毒性肺炎和細菌性肺炎，特別是對年老體弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或嬰幼兒，流感本身或其合併症可能引起死亡，應特別注意加強治療護理。
⒋2，預防措施
一般採用綜合性預防措施，講究衛生，注意體格鍛鍊和營養，保持室內空氣流通；對易感人群應採取相對隔離措施，如避免接觸病人，不去公共場所等；對年老體弱者必要時可採用滅活疫苗接種或服用金剛烷胺等預防方法（但須注意金剛烷胺僅對防治甲型流感有效）。
診斷標準
流行病學史
在流行季節一個單位或地區同時出現大量上呼吸道感染病人；或近期內該地區或鄰近地區上呼吸道感染病人明顯增多；或醫院門診上呼吸道感染病人明顯增多。
病原學診斷方法
A1 病毒分離
從疑似流感病人呼吸道採集標本分離病原體。
A2 標本的收集和處理
A2.1 標本收集時間應於發病早期（1～3d內）越早越好。
A2.2 標本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用於採集兒童標本，採集時將滅菌棉拭子稍沾標本收集液（pH7.2～7.6含20%～40%滅菌肉湯的生理鹽水或Hanks液或生理鹽水），反覆擦拭患者咽部數次，然後將此棉拭子放進裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用於採集成人標本，採集時先讓患者咳嗽，然後用10mL左右的收集液反覆洗漱咽喉部約1min，吐入管內。如有條件，兒童標本用負壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標本採集後置冰壺（4℃）中儘快送實驗室。
A2.3 標本的處理：用毛細吸管反覆吹打標本液（如為咽拭子標本，先反覆擠壓咽拭子後棄之），將粘液打散，於4℃靜置5～10min，待自然沉澱後取3mL上清，按每毫升加青黴素1000單位和鏈黴素1000μg，混勻置4℃處理2～4h即可接種。如標本污染較重，可置4℃過夜處理。如預計標本在48h內不能完成接種時，應將標本置低溫（最好-70℃）保存。
A3 接種及培養法
A3.1 雞胚培養法：取9～11日齡雞胚，將處理過的標本液經羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標本接種3～4隻胚，置33～35℃溫箱培養3d，然後將雞胚放置4℃冰櫃過夜（或置—20℃冰櫃1h再置4℃數小時）可分別收穫尿液和羊水，並作初步血凝（其方法是用毛細吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑膠板內，再加入1～2滴1%雞紅細胞，搖勻後置室溫或4℃30～45min觀察結果，根據血球凝集程度的不同可分為++++、+++、++、+、±、－），如血凝為+++～++++時，再按系列倍比稀釋測定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鑑定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。
A3.2 組織培養法：用0.2mL處理過的標本液接種於長成單層的原代人胚腎（或猴腎或地鼠腎），或狗腎傳代細胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份標本接種4管，置37℃吸附1～2h後棄標本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199維持液1mL，於33℃培養7～10d，並逐日觀察病變。從第三天開始每隔一天用0.4%雞或豚鼠紅細胞對培養管做紅細胞吸附試驗（試驗前無菌法收穫細胞培養上清液），如陰性則用已收穫的上清液盲目傳代，如陽性則測定上清液的血凝滴度。如標本第1代紅細胞吸附試驗陰性，可用收穫的全部上清液混合進行盲傳2代，仍為陰性則棄之。
A4 新分離株的鑑定
A4.3 補體結合試驗：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清對新分離病毒的血凝均不能抑制，則應考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作補體結合試驗定型。
血清學診斷方法
B1 血凝抑制試驗方法
B1.1 原理
一些動物紅細胞（如雞、豚鼠等）以及人“O”型血紅細胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產生紅細胞凝集現象，簡稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒（血凝素）預先作用後再加入紅細胞則不產生凝集，稱為血凝抑制現象。用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用後，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價。
B1.2 主要材料
B1.3 雙份血清收集及處理
急性期血清於發病3d內採取，恢復期血清於發病後2～4周採取。取0.1mL已分離的血清加入0.9（或0.4）mL霍亂濾液（RDE）（即1∶10或1∶5稀釋）搖勻，於37℃水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56℃水浴50min以滅活多餘的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素製備
B1.5 雞紅細胞懸液的製備
從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存於阿氏（Alsevr's）液中，置4℃保存。用前以生理鹽水洗3次，末次經2000r/min離心10min，將紅細胞用生理鹽水配成1%濃度。
B1.6 血凝素滴定
將流感病毒血凝素在大孔塑膠板內用生理鹽水從1∶5開始做系列倍比稀釋，每孔0.25mL再加入等量1%雞紅細胞，搖勻，置室溫或4℃30～45min後觀察結果，以出現十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價，即為1個血凝單位，實驗時採用4個血凝素單位，例如血凝素效價為1∶320，為1個單位，4個單位即為1∶80稀釋。正式實驗前經校對取4個血凝單位用於實驗。
B1.7 血凝抑制試驗步驟
B1.7.1 將上述已處理的待檢血清（1∶10或1∶5）再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4個單位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%雞紅細胞，搖勻置室溫或4℃30～45min。
B1.8 結果觀察
觀察結果時將血凝板傾斜數十秒鐘，待陰性孔內紅細胞自由下滑呈淚滴狀時讀結果。以出現完全抑制的血清最高稀釋度的倒數為抗體的效價。在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗中進行，並以恢復期血清抗體效價較急性期抗體效價升高4倍或4倍以上為陽性。
B2 型特異性補體結合試驗
B2.1 原理
B2.2 型特異免疫血清製備
B2.2.1 免疫用抗原
甲型為PR8株和乙型為Lee株均為小鼠適應株。於乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染後3～5d大部分小鼠發病、部分死亡時，解剖小鼠。取肺研磨並用生理鹽水製成10%的懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清製備
選體重300～500g的健康豚鼠，免前採血3～5mL，分離血清分裝凍存留作對照。豚鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次間隔一周，在末次免疫的同時，由腹腔注射鼠肺懸液2mL，一周后試血，如果對同型尿膜抗原的血清效價超過1∶80，而與異型抗原無交叉反應，立即採血分離血清分裝凍存於低溫（-20℃以下）。試驗前血清於56℃水浴滅活30min。
B2.3 可溶性抗原的製備
用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規接種和收穫尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上時，收穫其尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數小塊放入試管中，每個雞胚的尿囊膜加1mL無菌生理鹽水，凍化三次，末次化後以3000r/min離心15min，吸出上清即為可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰櫃至少可用一個月。
B2.4 雙份血清採集
收集病人急性期（發病3d內）和恢復期（發病10～30d後）的血清。血清於試驗前56℃30min滅活。
B2.6 補體結合試驗步驟
按常規進行。
B2.7 結果判定
B2.7.2 雙份血清對甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群補體結合抗體滴度一般在1∶16以下，如單份恢復期血清抗體在1∶32以上時，結合臨床症狀可作診斷的參考。
B2.7.4 人群血清抗體水平調查中，補體結合抗體在1∶32以上者可作為新近感染流感的證據。
B3 神經氨酸酶抑制試驗
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物經流感病毒的神經氨酸酶作用後，使N乙醯神經氨酸游離出來，經過碘酸鹽的氧化作用將N乙醯神經氨酸轉化為β－甲醛內酮酸，後者經硫代巴比妥酸作用形成生色團，用有機溶劑提取生色團，並在分光光度計上比色。利用上述反應可測知流感病毒的神經氨酸酶活性，反應的顏色越深酶活性越強。並可選擇用於神經氨酸酶抑制試驗的標準劑量。神經氨酸酶抑制試驗是將標化好劑量的神經氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液）和系列稀釋的被檢血清和正常血清起孵育，測知血清作用於神經氨酸酶活性的抑制效價，並計算出血清的神經氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及試劑
B3.2.1 小試管、10mL吸管及分光光度計等。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰凍乾燥的胎球蛋白加蒸餾水10mL，溶解後置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 過碘酸鈉溶液：稱4.8g過碘酸鈉（NaIO（下標始）4（下標終)）溶於38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸（濃），充分混合，置於棕色磨口瓶中，室溫保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸試劑：稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸的水浴中加熱溶解，每周新配。
B3.3 神經氨酸酶活性測定
B3.3.2 每管補充加入0.1mL生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配製的胎球蛋白底物，對照管用鹽水代替病毒，充分混合後置37℃水浴作用18h。
B3.3.3 從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入0.1mL的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min（時間要準）。
B3.3.4 每管加入1mL砷試劑，由於碘的釋放出現棕色，搖動試管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥試劑，並充分混合（該試劑需在煮沸溶解後加入），用棉塞將管口堵緊。
B3.3.6 立刻將試管置於煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現，即為神經氨酸酶活性的表現，顏色越深酶活性越高。
B3.3.7 將試管置冰水中冷卻後去掉棉塞，加入4mL丁醇試劑，換上乾淨橡皮塞，用手劇烈搖動試管，提取顏色使其轉到有機物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min離心5～10min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入乾淨的試管中待檢。
B3.3.10 酶單位的計算：酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度作為一個酶單位。
B3.4 神經氨酸酶抑制試驗
B3.4.1 按上述方法測定酶活性，選用1個酶單位的病毒稀釋度（即酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度），每管加入0.1mL。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配製的胎球蛋白0.1mL，充分搖勻，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出試管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各種試劑。
B3.4.5 測定光密度時應從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測方法同B3.3.9。
B3.5.2 計算公式
B（下標始）1（下標終）——酶活性高於50%的血清稀釋度倒數；
B（下標始）2（下標終）——酶活性低於50%的血清稀釋度倒數；
C（下標始）1（下標終）——高於50%的酶活性的百分數；
C（下標始）2（下標終）——低於50%的酶活性的百分數；
50——常數。
B3.5.3 計算舉例
先計算血清作用後的酶活性：
流感快速診斷方法
C1 直接檢查呼吸道脫落上皮細胞內抗原
C1.1 原理
由於流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細胞，因此在病人呼吸道標本的脫落細胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細胞內抗原即可診斷。檢查方法可採用免疫螢光法，一般於3～4h內即可完成，而且可以直接定型。
C1.2 標本的收集和製片
兒童標本最好採用負壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標本最好採用鼻咽洗液。可將每份標本分為兩份，一份低溫凍存備作病毒分離，一份用pH7.2磷酸緩衝液（PBS），將粘液吹打散，1500r/min離心15min去除上清，細胞沉澱用PBS洗1～2次，末次離心後棄上清，加入適量pH7.2 PBS使細胞重懸，滴加於帶圈的玻璃片上，自然乾燥，冷丙酮固定10min。
C1.3 間接免疫螢光法
C1.3.1 用10%新鮮羊或牛血清封閉標本片，置濕盒中於37℃30min。
C1.3.2 分別加入適當稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中於37℃放置1h。在PBS中洗兩次，共10min。
C2 標本經敏感細胞增殖1代後查抗原
C2.1 原理
病人呼吸道標本經接種敏感細胞（狗腎傳代細胞MDCK）增殖1～3d後，將細胞消化分散製成抗原片，再用免疫螢光法或免疫酶染法檢查細胞內抗原。由於標本中的病毒在敏感細胞增殖後查抗原，能明顯提高其診斷的敏感性，可在細胞病變出現以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規雞胚分離病毒法要快得多，一般24～72h即可診斷。檢查方法可採用間接免疫酶染法（C2.5）或間接免疫螢光法（C2.4）
C2.2 標本的收集及處理
兒童標本可採用咽拭子，最好採用負壓抽吸法；成人標本可採用咽漱液，最好採用鼻咽洗液。標本按附錄A（標準的附錄）中A2.3方法處理。
C2.3 標本的接種培養及製片
C2.4 間接免疫螢光法
C2.4.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.4.2 加兔抗鼠螢光素結合物同C1.3.3。
C2.5 間接免疫酶染法
C2.5.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.5.2 加適當稀釋度的羊抗鼠酶標結合物，濕盒中置37℃1h，用PBS洗兩次10min。
