基本介紹
- 中文名：副密碼子
- 外文名：Deputy codon
- 性質：胺基酸分子的區域
- 所屬領域：生物學
定義,概念,特點,實驗結論,發現,Normonly等人試驗,侯雅明和Schimmel試驗,與氨醯基tRNA的合成,意義,相關概念,tRNA的結構,密碼子與反密碼子,tRNA對胺基酸的識別,
定義
tRNA 分子上決定其攜帶胺基酸分子的區域稱為副密碼子。
概念
mRNA的核苷酸順序與蛋白質的胺基酸順序之間在結構上並沒有直接的相應關係,二者也不發生直接的相互作用。在這兩種不同的遺傳語言之間,必須通過譯員才能互相溝通。扮演這種譯員角色的就是各種tRNA分子。如果沒有tRNA的存在,也就無所謂密碼子了。因此密碼子的意義並不是單獨由mRNA決定的,而是由mRNA和攜帶胺基酸的tRNA相互作用所決定的。然而, tRNA分子上的反密碼子與其相應的胺基酸之間並無結構上的相關性,而且tRNA分子本身並不能催化相應胺基酸的荷載,而是需要相應的氨醯基-tRNA合成酶來催化。那么,氨醯基-tRNA合成酶又是如何識別它的兩個底物的呢? 對於胺基酸來說,該酶無疑是識別它們的側鏈基團; 而對於tRNA分子來說,氨醯基-tRNA合成酶又是識別哪個基團呢? 原來,每個tRNA分子上有一個特異的小區以供其氨醯基-tRNA合成酶所識別,這就是tRNA分子上的副密碼子。荷載相應胺基酸的tRNA分子並不能獨立地與mRNA發生作用,因為單靠密碼子與反密碼子三個鹼基對之間的氫鍵聯結是無法保證配對精確性的,更無法形成肽鍵並促成肽鏈的起始,延伸和終止。這就需要核糖體和有關因子的存在。在遺傳信息流動的各個過程中,參與翻譯過程的生物大分子數目最多。因此,翻譯過程是一個極為複雜的過程。
特點
（1）一種氨醯tRNA 合成酶可以識別一組同功tRNA （多達6個），它們的副密碼子有共同的特徵。
（2）副密碼子沒有固定的位置，亦可能不止1個鹼基對。
（3）儘管副密碼子不能單獨與胺基酸發生作用，但副密碼子可能與胺基酸的側鏈基團有某種相應性。
（4）並非所有的tRNA胺基酸柄上的G3·U70都是它的副密碼子。
實驗結論
用改變鹼基的方法研究其他tRNA的副密碼子，結果不但在胺基酸柄和反密碼子環上、而且在D環和TyC環上也找到“副密碼子”；而且對應於同一AARS來說，有好幾處“副密碼子”。所以把“副密碼子”的那些鹼基，改稱為AARS的認同要素(identity element)。
用化學法將E. coli的tRNAfMet約一半鹼基改變，表明胺基酸柄、D柄環和TyC柄環的鹼基改變，都可導致fMetRS使此tRNAfMet氨醯化的能力降低；而反密碼子環上C34、A35的改變，則完全不能被fMetRS氨醯化；說明tRNAfMet的反密碼子對fMetRS的識別起主要作用。
採用片段移植法將某種tRNA的某一片段移植到另一種tRNA上，然後測定其應接的氨醯基，結果表明在20種同功tRNA中，有17種的識別要素(recognition element)是在反密碼子上。
將tRNAfMet的反密碼子改造成為其他各種tRNA的反密碼子，進行翻譯實驗，測定第1位胺基酸殘基，結果仍然證明反密碼子對AARS的識別起重要作用。
同一種AARS識別要素往往是有幾處，但各處鹼基的作用有主次之分。例如胺基酸柄、73位和反密碼子，對於MetRS、AspRS、GlyRS的識別都起作用，但以反密碼子為主。
tRNA除了為相應的AARS提供認同的正控要素外，還要為其他AARS提供排斥的反控要素；tRNAAsnGUU的認同要素只是反密碼子上的單一核苷酸；如果將tRNAAsnGUU的反密碼子GUU改造成為tRNALys的反密碼子UUU，則不是被AsnRS認同，而是被LysRS認同，結果生成Lys-tRNAAsnGUU。
tRNA分子上出現多處AARS識別要素的原因在於AARS的不同。AARS按其亞基結構可以分為a1、a2、a4和（ab）4等多種。多肽鏈長短相差很大，從嗜熱脂肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilis）TrpRS的329aa，到E. coli ValRS的951aa。MW從59kDa~380kDa。
關於AARS識別tRNA上識別要素的機制問題，因AARS高解析度空間結構分析的數據很少而不明確。GlnRS的Asp235對識別至關重要。
發現
Normonly等人試驗
上世紀70年代初，發現tRNATyr琥珀抑制在胺基酸接受柄上的突變能使tRNATyr錯誤地攜帶Glu。1984年，Prather等發現突變的tRNALys不僅保留對Lys的特異性，而且也能攜帶Ala或Gly。這個突變的錯義抑制tRNALys是在胺基酸接受柄螺旋區的G3·C70被G3·U70鹼基對所取代。
Normanly等的實驗顯示，取代tRNALeu中的12個鹼基(無反密碼子鹼基的取代)，能夠使tRNALeu轉變為絲氨酸的tRNA。琥珀型抑制性tRNACys、tRNAPhe和tRNAAla，其反密碼子均是CUA，而它們卻攜帶不同的胺基酸。實驗證明tRNA胺基酸接受臂上的G3·U70是tRNAAla獨有的。對tRNAAla的36個非保守鹼基作28種定點突變(包括反密碼子改變)，只要保持G3·U70不變，仍能接受Ala；tRNAAla和tRNACys的G3·U70突變體，都能接受Ala甚至把tRNAAla的A9至C48或A14至U55缺失，只剩留有G3·U70的微型tRNAAla，仍能接受Ala；若把G3·U70改變，則不再接受A1a。將G3·U70引入tRNACys或tRNAPhe，亦可予二者攜帶Ala的功能。
tRNA胺基酸柄的3’CCA末端攜帶相應的胺基酸的作用是通過氨醯tRNA合成酶（AARS）完成的。AARS在密碼翻譯過程中十分重要。tRNA識別胺基酸的能力，是由AARS賦予的。反密碼子在決定tRNA的特異性並非是唯一的關鍵。如tRNAAla的胺基酸柄上的G3·U70似乎是tRNAAla的副密碼子，參與同AARS的作用。
侯雅明和Schimmel試驗
1988年Hou Ya-ming（候雅明）和Schimmel首先取得了這方面的突破。他們採用的方法是：選用發生色氨酸琥珀突變(UGG→UAG)的營養缺陷型E.coli (trp)來進行研究；這種突變型必須在加有色氨酸的培養基上才能生長。當用含有校正tRNA，它攜帶著Ala，但反密碼子突變成CUA，因此可以和終止密碼子UAG相配對，這樣校正了色氨酸的琥珀突變，在色氨酸突變位點加入了Ala 。轉化E.coli後只要校正率達到3%，該trp菌株就可在普通培養基上生長。然後他們用點突變的方法來改變校正tRNA（Ala）上的各個位點，觀察對識別Ala有何影響，以此來確定與識別特異胺基酸的有關位點。他們獲得了28個突變株。分別轉化E.coli (trp)，再檢測轉化後的E.coli (trp)在基本培養基上是否能生長。若仍能生長，說明相應的點突變位點和胺基酸的識別無關，若不能生長說明相應的點突變位點與tRNA的“身份”有關。
他們用上述方法證明了Ala tRNA的G3:U70鹼基對，僅一對鹼基決定了丙氨醯tRNA合成酶與tRNA的識別，他們就把這樣很小的元件稱之為tRNA的“identity”，或稱為副密碼子（paracodon）。到目前為止已知的tRNA的“身份”如表14-5所示。
表14--5 每種合成酶通過幾個特殊鹼基來識別其同質tRNA | |
tRNA | 合成酶識別的鹼基 |
一類氨基醯tRNA合成酶 | |
Val | 反密碼子上的三個鹼基 |
Met | 反密碼子上的三個鹼基 |
Ile | 反密碼子上的C34修飾鹼基 |
Gln | U35（反密碼子）; U1-A72和G73（受體臂） |
二類氨基醯tRNA合成酶 | |
Phe（酵母） | |
Ser | G1-C72; G2-C71; A3-U70(受體臂); C11-G24(D環) |
Ala | G3-U70(受體臂) |
Schimmel , Hou ya-ming和施建平等用合成的微螺旋做胺基酸接受試驗，證明只要具有Ala tRNA受體臂那樣長的微螺旋，或者具有該tRNA受體臂和TψC莖連在一起的小螺旋，且在受體臂有相當於G3-U70的鹼基對，它們就能接受Ala，已發現帶有了三種不同反密碼子（CUA, GGC, UGC）的Ala tRNA都具有G3-U70副密碼子。
表14-5表明這些位置的共同特點是：
（1）關鍵位點的數很少（1~5）個；
（2）副密碼子較集中在反密碼子和受體臂上，此與tRNA的L型三維結構和氨基醯-tRNA聚合酶結合的空間構型有關；
（3）由於一個鹼基對不能足以使20套tRNA被普遍的識別，因此不同的tRNA都有自己特殊的規律來進行識別。
與氨醯基tRNA的合成
胺基酸-tRNA是由胺基酸-tRNA合成酶催化產生的。這種酶需要三種底物即胺基酸,tRNA和ATP。ATP提供了活化胺基酸所需要的能量。胺基酸首先活化成胺基酸腺苷酸(這一中間產物與酶相結合),然後再與tRNA生成胺基酸-tRNA：
aa +ATP ←→aa-ADP + ppi
aa-ADP + tRNA ←→aa-tRNA + ADP
總反應： aa + tRNA + ADP ←→aa-tRNA + ADP + ppi
細胞內有20種胺基酸,有40種以上的tRNA,胺基酸tRNA合成酶是如何選擇正確的胺基酸和tRNA的呢? 人們至今尚未弄清其詳細作用機制。按照一般原理,酶和底物的正確結合是由二者相嵌的幾何形狀所決定的。只有適合的胺基酸和適合的tRNA進入合成酶的相應位點,才能合成正確的氨醯基-tRNA。現在已經知道合成酶與L形tRNA的內側面結合,結合點包括接受臂,DHU臂和反密碼子臂。在這幾個位點上的tRNA突變則妨礙正確的胺基酸接載。
乍看起來,反密碼子似乎應該與胺基酸的正確荷載有關,對於某些tRNA也確實如此。然而對於大多數tRNA來說,情況並非如此。人們早就知道,來源於少數tRNA的抑制tRNA,儘管它們的反密碼子已經改變(識別無義密碼子),但它們攜帶胺基酸的性質並沒有改變。1986年,Normanly等人將亮氨酸tRNA分子中置換了12個核苷酸(反密碼子未動),則變成了攜帶絲氨酸的tRNA。1988年,侯雅明和Schimmel做了十分出色的試驗:將丙氨酸抑制tRNA(tRNAAla/CUA)分子突變了許多位點,組成了28種突變體(14種在接受臂上)。結果發現,許多突變體都不改變接載丙氨酸的性質,而只有改變G3:U70這一鹼基對的突變體才表現出明顯的突變效應(不能抑制trpA基因中第234個amber無義突變)。另外兩種amber抑制tRNA(tRNACys/CUA,tRNAPhe/CUA)雖然對於trpA基因中的無義突變能夠抑制,但都不能恢復TrpA+表現型,因為半脫氨酸或苯丙氨酸的插人都不能形成有活性的α亞基。儘管這兩個抑制tRNA分別有38個和31個核苷酸不同於tRNAAla/CUA,但是如果將它們的C3:U70改變為G3:U70,均能為丙氨酸tRNA合成酶所識別。這就說明,G3:U70是丙氨酸tRNA分子決定其本質(攜帶丙氨酸)的主要因素。
由上所述,可以看出,一種胺基酸tRNA合成酶可以識別一組同功tRNA(最多達6個),這說明它們具有共同特徵。例如丙氨酸tRNA合成酶識別G3:U70,在已發現的三種丙氨酸tRNA(tRNAAla/CUA,tRNAAla/GGC,tRNAAla/UGC)都具有G3:U70副密碼子。但還沒有充足的證據說明其他氨醯基tRNA合成酶在其同功tRNA組中也是識別相同的副密碼子。其次,副密碼子並沒有固定的位置,亦可能並不止一個鹼基對。例如上述的tRNACys/CUA和tRNAPhe/CUA都具有C3:G70,顯然它們的副密碼子不在C3:G70或者不完全在C3:G70,因為它們攜帶兩種不同的胺基酸。第三,儘管副密子不是單獨與胺基酸發生作用,但是副密碼子可能與胺基酸的側鏈基團有某種相應性。tRNA分子對錯誤接載的胺基酸具有校對功能,可能就是來源於這種相應性。副密碼子可能是從立體化學上決定相應胺基酸的"原始副密碼子"(protoparacodon)進化而來。人們早就推測,tRNA分子起源於能夠攜帶胺基酸的寡聚核苷酸。這種識別胺基酸的特異性在某種程度上保留下來,而反密碼子是在tRNA分子進化過程中後來才出現的。這就是說,副密碼子比密碼子和反密碼子更為古老。
關於胺基酸-tRNA合成酶和tRNA參與校對的分子細節還不清楚。該系統可以通過多級的校對功能排除錯誤的接載。其中主要有動力學校對(Kinetic proofreading),構象校對(conformational proofreading)和化學校對(chemical proofreading)。動力學校對是基於合成酶對於錯誤胺基酸形狀的識別,即使生成胺基酸腺苷酸形式,也會將它水解。構象校對是在氨醯基腺苷酸生成以後,由於tRNA的進入引起酶構象的改變,使得已生成的氨醯基腺苷酸不符合進一步連線成胺基酸-tRNA的要求,從而水解之。化學校對是指錯誤的胺基酸已接載到tRNA上之後,被合成酶的tRNA結合位點所發現,然後水解之。雖然說不少人傾向於最後一步機制,但都缺少令人信服的證據。
意義
破譯副密碼子的意義不僅僅限於tRNA分子本身生物學功能的認識，更重要的是將對生物化學，生物起源，分子生物學及遺傳學產生重大影響。
相關概念
tRNA的結構
tRNA1.tRNA結構保守：70-80個鹼基。
2.二級結構：三葉草。
3.五個主要臂：(1)接受臂：攜帶胺基酸；(2)TΨC臂；(3)反密碼子臂；(4)雙氫尿嘧啶臂（DHU）；
(5)附加臂：大小反映了整個tRNA分子的大小，根據其大小，tRNA分為兩類：第Ⅰ類tRNA，3/4 tRNA只有3-5個鹼基的附加臂；第Ⅱ類tRNA，其餘含有13-21鹼基的附加臂。
4.三級結構：倒L形
(1)所有的tRNA分子均具有L形狀，採取A構象；
(2)接受臂上存在G·U配對；
(3)三維結構靠氫鍵堆積力；
(4)所有的tRNA具有同樣得空間結構。
(5)接受臂、反密碼子臂位於雙螺旋的兩端；
(6)TΨC臂位於L的兩臂交間處；
(7)維持空間結構的力是氫鍵和鹼基堆積力。
