基本介紹
- 中文名：分子標記
- 概念：有廣義和狹義之分。
- 狹義分子：指能反映生物個體
- 基因組中：的特異性DNA片段
概念,理想要求,標記技術,DNA標記,DNA晶片,遺傳標記,套用領域,技術展望,
概念
分子標記（Molecular Markers），是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用於標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記技術已有數十種，廣泛套用於遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關係鑑別、基因庫構建、基因克隆等方面。
理想要求
理想的分子標記必須達以下幾個要求：⑴ 具有高的多態性；⑵ 共顯性遺傳，即利用分子標記可鑑別二倍體中雜合和純合基因型；⑶ 能明確辨別等位基因；⑷ 遍布整個基因組；⑸ 除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布於整個基因組；⑹ 選擇中性（即無基因多效性）；⑺ 檢測手段簡單、快速（如實驗程式易自動化）；⑻ 開發成本和使用成本儘量低廉；⑼ 在實驗室內和實驗室間重複性好（便於數據交換）。但是，發現的任何一種分子標記均通過電泳分離不同的生物 DNA 分子，然後用經標記的特異 DNA 探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術來揭示 DNA 的多態性。
① 限制性片段長度多態性
(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
1974年Grodzicker等創立了限制性片段長度多態性（RFLP）技術，它是一種以DNA—DNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。RFLP基本原理：利用特定的限制性內切酶識別並切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產生的DNA數目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然後與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化後產生片段在長度上差異。由於不同個體的等位基因之間鹼基的替換、重排、缺失等變化導致限制內切酶識別和酶切發生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。
RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標記位點數量不受限制，通常可檢測到的基因座位數為1—4個。RFLP技術也存在一些缺陷，主要是克隆可表現基因組DNA多態性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。自RFLP問世以來，已經在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的套用。
② 數目可變串聯重複多態性
(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）
數目可變串聯重複序列又稱小衛星DNA(Minisatellite DNA），是一種重複DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數10一10001不等。VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內切酶和DNA探針有特殊要求：⑴限制性內切酶的酶切位點必須不在重複序列中，以保證小衛星或微衛星序列的完整性。⑵內切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛星序列所在片段含有較少無關序列，通過電泳可充分顯示不同長度重複序列片段的多態性。⑶分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛星序列或微衛星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛星或微衛星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。
小衛星標記的多態信息含量較高，在17一19之間。缺點是數量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的套用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點。
標記技術
隨機引物的PCR標記
所用引物的核苷酸序列是隨機的，其擴增的 DNA 區域事先未知。隨機引物PCR擴增的 DNA 區段產生多態性的分子基礎是模板 DNA 擴增區段上引物結合位點的鹼基序列的突變，不同來源的基因組在該區段上表現為擴增產物有無差異或擴增片段大小的差異。隨機引物PCR標記表現為顯性或共顯性。
① 隨機擴增多態性DNA
(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)
RAPD技術是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法。基本原理：它是利用隨機引物（一般為8—10bp）通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然後用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所使用的引物各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點，一旦基因組在這些區域發生DNA片段插人、缺失或鹼基突變，就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化，從而導致擴增產物數量和大小發生改變，表現出多態性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區域DNA多態性，但利用一系列引物則可使檢測區域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用於對整個基因組DNA進行多態性檢測，也可用於構建基因組指紋圖譜。
與RFLP相比，RAPD具有以下優點：⑴技術簡單，檢測速度快；⑵ RAPD分析只需少量DNA樣品；⑶不依賴於種屬特異性和基因組結構，一套引物可用於不同生物基因組分析；⑷成本較低。但RAPD也存在一些缺點：⑴ RAPD標記是一個顯性標記，不能鑑別雜合子和純合子；⑵存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但鹼基序列組成不同的DNA片段；⑶ RAPD技術中影響因素很多，所以實驗的穩定性和重複性差。
② 任意引物PCR
(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP—PCR）
AP—PCR方法不需預知序列資料，而且檢測的基因組樣本是任意的，還能夠用於檢測近等基因系（或同類系）中的多態性。AP—PCR的缺點是每個新的多態性都必須經純化才能進一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長度多態性。
③ DNA擴增指紋印跡
(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)
DAF是一種改進的RAPD分析技術，與RAPD技術不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短（一般為5一8 bp），因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當使用5個核昔酸的引物時，引物和模板的組合大約可擴增出10一100個DNA片段。PCR擴增產物是在凝膠上進行分離，通過銀染即可產生非常複雜帶型。
特異引物的PCR標記
① 序列標誌位點
(Sequence Tagged Sites，STS)
STS是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統稱。通過設計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結合位點結合，從而可用來擴增基因組中特定區域，分析其多態性。利用特異PCR技術的最大優點是它產生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模糊性。
② 簡單重複序列
(Simple Sequence Repeat，SSR)
簡單重複序（SSR）也稱微衛星DNA，其串聯重複的核心序列為1一6 bp，其中最常見是雙核苷酸重複，即（CA) n和（TG) n每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重複單位數目10一60個，其高度多態性主要來源於串聯數目的不同。SSR標記的基本原理：根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由於核心序列串聯重複數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型並計算等位基因頻率。
SSR具有以下一些優點：（l）一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；⑵微衛星呈共顯性遺傳，故可鑑別雜合子和純合子；⑶所需DNA量少。顯然，在採用SSR技術分析微衛星DNA多態性時必須知道重複序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA資料庫查尋則首先必須對其進行測序。
③ 序列特異性擴增區
(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR）
④ 單引物擴增反應
(Single Primer Amplification Reaction，SPAR)
SPAR技術是與RAPD技術相似的一種標記技術，SPAR也只用一個引物，但所用的引物是在SSR的基礎上設計的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進行特異性結合，然後通過PCR技術擴增SSR之間的DNA序列，凝膠電泳分離擴增產物，分析其多態性。另外，還有一種與SPAR技術非常相似的標記技術，即ISTR (Inverse Sequence—tagged Repeat）技術，ISTR所用的引物是在反向重複序列基礎上設計的，PCR擴增的是反向重複序列之間的DⅣA序列。
⑤ DNA單鏈構象多態性
(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)
SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產生構象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現為電泳遷移率的差別。單鏈DNA構象分析對DNA序列的改變非常敏感，常常一個鹼基差別都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PCR技術定點擴增基因組DNA中某一目的片段，將擴增產物進行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，根據條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結果判定是通過多個樣品之間對比，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個體的DNA特異性，達到指紋分析目的。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結合。其中與雜交雙鏈分析（Heterocluplex analysis，Het）法結合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對鹼基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。對同一靶序列分別進行SSCP和Het分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。
⑥ 雙脫氧化指紋法
(Dideoxy Fingerprints，ddF)
ddF是將雙脫氧末端終止測序法與SSCP結合起來的分析技術，對由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進行SSCP分析。如果目的片段存在一個突變，則所有大於某一大小對應於突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統，對於每一個突有多次機會檢測其遷移率改變，提高了檢測突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時因DNA長度影響SSCP顯示的困難，通過一種雙脫氧核昔酸生產特異性的單鏈DNA，使其中長度合適的DNA片段顯示SSCP改變。
DNA標記
① 擴增片段長度多態性
(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)
AFLP是1995年荷蘭科學家Zabeau和Vos等發展起來的一種檢測DNA多態性的新方法，文章發表於Nucleic Acids Research。AFLP 是 RFLP 與PCR相結合的產物，其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板 DNA，然後以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最後在接頭互補鏈的基礎上添加 1—3個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。引物由三部分組成：與人工接頭互補的核心鹼基序列、限制性內切酶識別序列、引物3’端的選擇鹼基序列（1—10 bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個鹼基序列為結合位點。該技術的獨特之處在於所用的專用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可對酶切片段進行PCR 擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般採用兩個限制性內切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數較少，因而 AFLP 分析產生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP 結合了 RFLP 和 RAPD兩種技術的優點，具有解析度高、穩定性好、效率高的優點。但它的技術費用昂貴，對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。儘管 AFLP 技術誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術的又一次重大突破，被認為是一種十分理想、有效的分子標記。
② 酶切擴增多態性序列
(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS）
CAPS技術又稱為PCR—RFLP，它實質上是PCR技術與RFLP技術結合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點的DNA序列資源設計出一套特異性的PCR引物（19—27bp），然後用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色並進行RFLP分析。CAPS標記揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標記，其優點是避免了RFLP分析中膜轉印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由於很多限制性內切酶均可與擴增DNA酶切，所以檢測到多態性機會較大。
DNA晶片
核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)
SNP標記是美國學者Lander E於1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP 標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異。人類基因組大約每 1250 bp SNP 出現一次，已有2000多個標記定位於人類染色體，對人類基因組學研究具有重要意義。檢測 SNP 的最佳方法是 DNA 晶片技術。SNP 被稱為第三代 DNA 分子標記技術，隨著 DNA 晶片技術的發展，其有望成為最重要最有效的分子標記技術。
遺傳標記
基因型的特殊的易於識別的表現形式。其最基本的兩個特性是：
可遺傳性。
可識別性（多態性）。
遺傳標記是研究遺傳現象和物種進化的不可缺少的工具。
套用領域
基因組作圖和基因定位研究
長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據諸如形態、生理和生化等常規標記來構建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數種類的生物，而且圖譜解析度大多很低，圖距大，飽和度低，因而套用價值有限。分子標記用於遺傳圖譜構建是遺傳學領域的重大進展之一。隨著新的標記技術的發展，生物遺傳圖譜名單上的新成員將不斷增加，圖譜上標記的密度也將越來越高。建立起完整的高密度的分子圖譜，就可以定位感興趣的基因。
基於圖譜克隆基因
圖位克隆(Map—bascd cloning））是近幾年隨著分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發展起來的一種新的基因克隆技術。利用分子標記輔助的圖位克隆無需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表達產物，就可以直接克隆基因。圖位克隆是最為通用的基因識別途徑，至少在理論上適用於一切基因。基因組研究提供的高密度遺傳圖譜、大尺寸物理圖譜、大片段基因組文庫和基因組全序列，已為圖位克隆的廣泛套用鋪平了道路。
物種親緣關係和系統分類中的套用
用於疾病診斷和遺傳病連鎖分析
1980年，Bostein等成功的將PFLP技術用於鐮刀型貧血症的診斷分析，開創了基因診斷的先河。PFLP是以孟德爾方式遺傳，因此可以作為染色體上致病基因座位的遺傳標誌。許多與相連鎖的致病基因得以定位。小衛星和微衛星因其高度多態性而被廣泛用於疾病診斷和遺傳病的連鎖分析。隨著高通量SNP檢測技術方法的出現，作為數量最多且易於批量檢測的多態標記，SNP在連鎖分析與基因定位，包括複雜疾病的基因定位、關聯分析、個體和群體對環境致病因子與藥物的易感性研究中將發揮愈來愈重要的作用。
技術展望
分子標記技術已飛速發展，並被廣泛套用於動植物的遺傳研究中。分子標記中的已在玉米、大豆、雞、豬等動植物育種和生產中有許多套用研究，主要集中在基因定位、輔助育種、疾病治療等方面的套用研究工作，取得了一些套用成果。分子標記技術的開發是分子生物學領域研究的熱點。隨著分子生物學理論與技術的迅猛發展，必將研發出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記技術。而分子標記技術與提取程式化、電泳膠片分析自動化、信息（數據）處理計算機化的結合，必將加速遺傳圖譜的構建、基因定位、基因克隆、物種親緣關係鑑別及與人類相關的致病基因的診斷和分析。
圖片為AFLP的銀染檢測結果
