限制性核酸內切酶

限制性核酸內切酶是可以識別並附著特定的脫氧核苷酸序列，並對在每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性內切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內切酶同時具有修飾及認知切割的作用。

基本介紹

• 中文名：限制性核酸內切酶
• 外文名：Restriction endonuclease
• 作用：切割DNA
• 別名：限制酶 限制性內切酶

定義

是識別特定的核苷酸序列，並在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶。

由來

一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株（品系）。例如，從Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性內切酶稱為Bam H，在同一品系細菌中得到的識別不同鹼基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等。

限制性核酸內切酶

別名：Endodeoxyribonuclease簡稱限制酶

酶反應 限制性內切酶能分裂DNA分子在一限定數目的專一部位上。它能識別外源DNA並將其降解。

單位定義：在指明pH與37℃，在0.05mL反應混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。

性狀製品不含非專一的核酸水解酶（由10單位內切酶與1μg λDNA，保溫16小時所得的凝膠電泳圖譜的穩定性表示），這類酶主要是從原核生物中分離出來的，迄今已經從近300多種不同的微生物中分離出約4000種限制酶。

分布區域

限制性核酸內切酶分布極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發現至少一種限制性內切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現已發現的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，酶含量極高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高產酶菌株。據報導從10g的H. aegyptius的細胞中，能分離提純出可消化l0gλ噬茵體DNA的酶量。到目前為止，細菌是限制性內切酶，尤其是特異性非常強的I類限制性內切酶的主要來源。

分類性質

根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬於I類酶。其分子量較大；反應過程中除需Mg²⁺外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。因此，I類酶作為DNA的分析工具價值不大。Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小於105道爾頓；反應只需Mg²⁺；最重要的是在所識別的特定鹼基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用後，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑑別。

限制性內切酶識別DNA序列中的迴文序列。有些酶的切割位點在回文的一側（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在迴文序列中間，形成平整末端。Alu I的切割位點如下：

5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5'

在已發現的限制性內切酶中，近百種酶的識別順序已被測定。有很多來源不同的酶有相同的鹼基識別順序，這種酶稱為“異源同功酶”（isochizomer，同切限制內切酶；同裂酶）。應該注意的是，這些酶雖然有相同的識別順序，但它們的切點並不完全一樣。例如Xma I和Sma I都識別六核苷酸CCCGGG，但Xma I的切點在CcCCGGG，而Ema I的切點則在CCCgGGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG粘性末端的DNA片段，而後者並不形成粘性末端（而叫平末端）。當然，也有識別順序和切點都相同的酶，如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、Mno I，都在識別順序CCGG內有一相同的切點，Hal Ⅲ和BsuR I同樣在識別順序GGCC內有一相同的切點。

用途

用於DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子鹼基序列分析；比較相關的DNA分子和遺傳工程。

限制性核酸內切酶是由細菌產生的，其生理意義是提高自身的防禦能力.

限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。

命名

限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例：

E	Escherichia	（屬）
co	coli	（種）
R	RY13	（品系）
I	首先發現	在此類細菌中發現的順序

類型

根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。

第一型限制酶

同時具有修飾（modification）及識別切割（restriction）的作用；另有識別（recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距離識別位（recognition site）可達數千個鹼基之遠。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶

只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的迴文序列（palindrome sequence）；所剪下的鹼基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindⅢ。

第三型限制酶

與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24-26個鹼基對。例如：HinfⅢ。

生理意義

限制作用實際就是限制酶降解外源DNA ，維護宿主遺傳穩定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。所以，能產生防禦病毒侵染的限制酶的細菌，其自身的基因組中可能有該酶識別的序列，只是該識別序列或酶切位點被甲基化了。但並不是說一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數限制酶對DNA甲基化敏感，因此當限制酶目標序列與甲基化位點重疊時，對酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對甲基化DNA的切割能力是限制酶內在和不可預測的特性，因此，為有效的切割DNA，必須同時考慮DNA甲基化和限制酶對該類型甲基化的敏感性。另外，大部分商業限制酶如今專門用於切割甲基化DNA。