DNA限制性內切酶酶切是一項基於DNA限制性內切酶的基因工程技術，其基本原理是利用限制性內切酶對DNA上特定序列的識別，來確定切割位點並實現切割，從而獲得所需的特定序列。
基本介紹
- 中文名：DNA限制性內切酶酶切
- 類別：基因工程技術
- 基本原理：利用限制性內切酶識別
- 基於：DNA限制性內切酶
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相關介紹
生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶（簡稱限制酶）。
酶切原理
限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，並切割雙鏈DNA。它可分為三類：
Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴於ATP的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然後從底物上解離。
Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛套用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少數酶識別更長的序列或簡併序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。
示意圖：
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
影響因素
影響條件
處理方法
當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時，會影響其進一步使用，因此在吸取限制性內切酶時，每次都要用新的吸管頭。如果採用兩種限制性內切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。
若兩者可用同一緩衝液，則可同時水解。
若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用，隨後調節鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成後，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻後置-70℃低溫冰櫃30分鐘，離心、乾燥並重新溶於緩衝液後進行第二個酶切反應。
