DNA限制性內切酶消化是基因分析中的關鍵步驟。內切酶是最關鍵的工具酶。限制性內切酶是一類具有嚴格識別位點，並在識別位點內或附近切割雙鏈DNA的脫氧核糖核酸酶。一定的 DNA分子的核苷酸順序是一定的，某種限制性內切酶作用於該DNA的切點數一定，故所得的 DNA片段數和片段的大聚丙烯酸胺凝膠電泳分離，以標準 DNA作對照，溴化乙錠染色後，測出各 DNA片段移動的位置和距離。以各標準 DNA片段的分子量對數為縱坐標，各標準 DNA片段的移動距離為橫坐標，求出各樣品DNA片段的分子大小。
基本介紹
- 中文名：DNA限制性內切酶消化
- 概括：是基因分析中的關鍵步驟
- 內切酶：是最關鍵的工具酶
- 屬於：DNA實驗
[操作],[注意事項],[試劑和器材],
[操作]
l．樣品DNA的限制性內切酶消化
（1）取 2μg樣品 DNA溶液加入 0.5ml的 Eppendorf管中，加2μl 10×限制性內切酶緩衝液，6～10個U的相應限制性內切酶，加消毒雙蒸水至總體積20μl，於37℃保溫酶解2小時，按上述條件用適當的幾種不同的內切酶進行單酶或雙酶解。
（2）在 65℃加熱 5分鐘或用適量的 0.5 mol/L EDTANa2終止反應。
2．DNA酶解片段的電泳分離
取DNA酶解作品2μl加上樣緩衝液10μl（含溴酚藍指示劑和甘油），在0.8%瓊脂糖（含0.5μg/ml溴化乙錠）凝膠進行水平電泳，電壓<5V/cm，時間2小時左右，用紫外燈觀察分析。
[注意事項]
1．分子克隆是微量操作技術，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。
2．要注意酶切時加樣的次序，一般次序為水、緩衝液、DNA各項試劑，最後才加酶液。取液時，Tip頭要從溶液表面吸取，以防止Tip頭沾去過多的液體與酶，待用的內切酶要放在冰浴內，用後蓋緊蓋子，立即放回-20℃冰櫃，防止限制性內切酶的失活。
3．凡用在酶切反應中的一切塑膠器皿（Eppendorf管，Tip頭等），都要新的，最後用重蒸水清洗，濕熱滅菌，置50℃溫箱中烘乾，使用前打開包裝，用鑷子夾取，不直接用手去拿，嚴防手上雜酶污染。
4．當樣品在37℃與65℃保溫時，要注意：
（l）防止因蓋子未蓋嚴密使水汽進入管內，使反應溶液體積大量增加，造成實驗失敗。
（2）防止由於標籤脫落，分不清樣品類型。
5．由於溫差原因，往往在蓋上有水汽，因此樣品酶切完畢或中間取樣電泳要離心2秒鐘，以集中體積內溶液，否則會發現酶切後體積少了。
[試劑和器材]
1．試劑
（1）限制性內切酶：如 EcoRI、Hind Ⅲ、PstⅡ、BamH1等，-20℃貯存。
（2）樣品 DNA：如 λDNA、pBR322等，-20℃貯存。
（3）限制性內切酶緩衝浪配製，見下表（用消毒雙蒸水配製，貯存於-20。C）；
（4）10×TBE電泳緩衝液:0.89 mol/L Tris；0.89 mol/L硼酸；0.02 mol/L EDTA Na2 pH8.0，高溫滅菌，貯存於4℃。
（5）6×上樣緩衝液：0.25%溴酚藍；40%蔗糖；用消毒雙蒸水配製，貯存於4℃。
（6）溴化乙錠溶液：稱取溴化乙錠5mg溶解於lml消毒雙蒸水中，4℃避光保存。
（7）消毒雙蒸水。
2. 器材
恆溫水溫箱；電泳儀；水平電泳糟；50μl可調移液器；紫外燈（上海康華生化儀器製造廠）。
