限制性核酸內切酶圖譜分析

限制酶圖譜（restriction map）:同一DNA用不同的限制酶進行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點，由此建立的位點圖譜有助於對DNA的結構進行分析。 限制性核酸內切酶分析技術是病原變異、毒株鑑別、分型及了解基因結構和進行流行病學研究的有效方法，對動物檢疫有很重要的實用意義，尤其對區別進出境動物及動物產品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。

限制性核酸內切酶

(Restriction endonuclease)

作用及分類

限制性核酸內切酶(以下簡稱限制性酶)是一類識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內切方式水解DNA，產生5’-P和3’-OH末端。

1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時發現了宿主控制性現象。Arber及其同事用放射性同位素標記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自己的DNA並不降解，據此他們提出了限制 - 修飾酶假說。對於一個宿主細胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其細胞中的一對酶，它們對DNA底物有相同的識別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內部拆卸水解，甲基化酶是修飾，DNA分子經修飾後，就可逃避限制性酶的識別，而甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。

限制性酶主要分為三種類型：Ⅰ型限制酶為複合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在 DNA鏈上沒有固定的切割位點，一般在離切割位點1kb到幾kb的地方隨機切割，不產生特異性片段。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特異性的切割位點，但這兩類酶對 DNA酶切分析的意義不大，通常所說的限制性內切酶是指Ⅱ型酶，它能夠識別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸順序，產生特異性的DNA片段。

識別序列及消化產物的末端結構

限制性酶的識別序列，大部分具有雙軸對稱性結構或稱迴文序列，如EcoRI的識別序列為：

GAA

TTC

橫軸

CTT

AAG

縱軸

將縱軸一側的序列以橫軸為中心旋轉180°，則縱軸兩側的序列相互對稱，這種結構又稱為雙重對稱結構。大部分酶的識別序列長度為4-6個核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現頻率高，對一隨機排列的DNA分子來說，理論值為1/44，因此4核苷酸識別序列的限制性酶在DNA鏈上切點多，產生片段的數目多，長度短，顯示出酶的特異性較低。對於5和6核苷酸識別序列的酶，出現頻率分別為1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出現頻率低，酶的特異性強，而8核苷酸識別位點在DNA鏈中出現機率更低(1/48 )，特導性更強，可提供更長的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對稱性序列，其回文識別序列被個或幾個其他核苷酸所間隔，如BglⅠ，這種酶的特異性比識別長度相同的典型迴文序列的酶略高。另外有些限制性酶(約10種，如BbVⅠ等)，其識別序列不表現為迴文結構，它們降解雙鏈DNA時，酶切點大部分不在識別序列內，而是與識別序列相距5至13個核苷酸殘基不等。

限制性酶切片段的末端結構：限制性酶不但有特定的識別序列，並且任何一種酶切割 DNA鏈時，總是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產物的5’端帶磷酸單酯基團，而3’末端則為游離羥基。因此某一種酶的全部產物的末端具有相同的結構。根據切點序列的結構特點，產物的末端可分為粘性末端和平末端兩類。粘性末端指酶切後DNA片段末端帶有1-4個核苷酸殘基的單鏈結構，而片段兩端突出的單鏈具有互補性，突出的單鏈因部位的不同，又可分為5’-與3’-粘性末端兩種，突出的單鏈帶5’磷酸單酯的稱5’-粘性末端，而突出的單鏈含3’-羥基則稱3’-粘性末端。平末端指酶切後，片段為齊頭末端結構。在DNA體外重組時，粘性末端是DNA連線酶的有效底物，有很高的連線效率。

影響酶催化反應的因素

限制性酶切反應速度與底物的性質有很大的關係，底物的單雙鏈結構、分子的構型、DNA鏈中酶識別位點的數目以及位點附近的序列等都影響著酶的催化反應。共價閉合環(超螺旋構型)DNA比其相應的線性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構型DNA徹底降解，需要的酶量就大。對於DNA-RNA雜合雙鏈的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8種酶切時，結果其 DNA鏈可被切割，但酶用量比雙鏈DNA大20-50倍。部分限制性酶還可切割單鏈DNA，如 Hae Ⅲ等。

每一種限制性酶都有自身的識別特異性，在通常酶反應條件下，特異性不會改變，但在特殊條件下，某些酶的特異性會隨之改變，如當反應緩衝液的pH由7.5升高至8.5，或甘油濃度超過5%，或用Mn艹代替Mg艹時EcoRI的識別序列由原來的GAATTC變為AATT，結果是DNA鏈上切點數量增加，產物片段變小，因此在不合適的反應條件下，限制性酶可表現與原來特異性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要確保酶解條件，注意底物DNA的純度，儘可能防止酶的第二活性。

反應液中鹽的濃度是至關重要的，因此要根據所使用的酶來確定鹽的濃度。限制性酶對鎂離子的要求並不嚴格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般為每微克DNA 1-5單位，為保險起見以過量3-5倍為宜，但最好先作預實驗。

從理論上講，延長反應時間可以節省酶，但長時間消化受酶的穩定性、雜酶的影響等因素的制約。國產酶不宜超過1.5小時，其他酶一般也以1-2小時為宜。酶切反應的溫度一般在 37℃，只有少數酶要求特殊反應溫度，如TaqⅠ要求65℃。低於37℃時大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。許多酶可用熱處理(65℃)10-15分鐘使酶反應終止，但並非所有酶都能熱終止，不能熱終止的酶可用過量EDTA終止或用酚提取來終止。

酶切分析操作步驟及酶切分析套用

操作步驟

以動物病毒為例說明酶切反應步驟。

病毒DNA的提取和純化

當繁殖病毒的細胞出現80%-100%的細胞病變時(CPE)，收穫並凍融三次使細胞破裂釋放出病毒，3 000r/min離心10分鐘，吸出上清，加10% SDS至終濃度為1%，於56℃水浴作用30分鐘，加等體積的飽和酚，混勻10 000r/min離心10-15分鐘，取上清反覆抽提至界面無蛋白質為止，取上清用乙醚去酚數次，真空除去乙醚，然後加2.5倍預冷無水乙醇，沉澱核酸，12 000r/min離心後，核酸沉澱再用70%乙醇洗滌兩次，pH8.0 TE緩衝液溶解，取少量用紫外分光光度計測其含量和純度，其餘置－20℃貯存備用。

酶切反應

將病毒DNA用TE溶解為大約0.5μg/μl。然後依次加入5μl 10×酶切緩衝液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用滅菌雙蒸水補足至50μl，在振盪器上溫和振盪幾秒鐘，然後稍稍離心(3 000r/mmin)數秒，以使管壁液體集中於管底，37℃恆溫水浴中孵育1小時，65℃水浴作用10分鐘，或用EDTA終止反應。

電泳

依據酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠作為支持物進行電泳，同時加入標準DNA作分子量參照物，經溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應的光源下觀察結果並拍攝記錄電泳圖譜。

以上為酶切反應操作的基本過程。如果進行多酶切反應，則要考慮反應緩衝液要基本適用於所用的各種酶。若兩種以上的酶對緩衝液要求不同，如鹽濃度要求不同時，先進行低鹽要求的酶切反應，再進行高鹽要求的反應，對反應溫度要求不一的也是先進行低溫度酶切，再進行高溫度酶切。

酶切分析套用

限制性核酸內切酶在分子生物學研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個研究領域都離不開限制性內切酶，其套用非常廣泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便於序列分析；DNA重組和組建新質粒；建立DNA的物理圖譜等。

用限制性內切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成為一種常用的方法，通過酶切消化DNA，然後電泳染色呈現大小不一的片段，對這些片段的遷移率及數量進行分析，便可了解到病原微生物遺傳物質的一定特性，在此基礎上採用雙酶切割或雜交等方法，則可推測出片段的排列順序和酶切位點，從而推斷出DNA間存在的相似性或差異性，對於動物病毒尤其是對疫苗毒、野毒及變異毒株的檢測具有重要的意義。