基本介紹
- 中文名：酵母人工染色體
- 外文名：Yeast artificial chromosomes
- 簡稱：YAC
- 用來：構建大片段 DNA 文庫
標記基因,複製元件,端粒重複序列,著絲粒,自主複製序列,標記方法,工作原理,研究現狀,現實意義,
標記基因
在 YAC載體中最常用的是 pYAC4 。由於酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態也是線狀的。但是，為了方便製備YAC載體， YAC 載體以環狀的方式存在，並增加了普通大腸桿菌質粒載體的複製元件和選擇標記，以便保存和增殖。
複製元件
YAC 載體的複製元件是其核心組成成分，其在酵母中複製的必需元件包括複製起點序列即自主複製序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用於有絲分裂和減數分裂功能的著絲粒（centromere , CEN）和兩個端粒（TEL）。
YAC 載體為能夠滿足自主複製、染色體在子代細胞間的分離及保持染色體穩定的需要，必須含有以下元件：
端粒重複序列
（telomeric repeat ， TEL）：定位於染色體末端一段序列，用於保護線狀的 DNA 不被胞內的核酸酶降解，以形成穩定的結構。
著絲粒
（centromere ， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點， 使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中 。在 YAC 中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。
自主複製序列
（autonomously replication sequences，ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向複製所必須的信號。
標記方法
YAC 載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在於細胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象，可用於篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。
工作原理
YAC 載體主要是用來構建大片段 DNA 文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，並不用作常規的基因克隆。圖3-26是 pYAC4 的遺傳結構圖，當用BamHⅠ切割成線狀後，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體複製的必要順式元件，如自主複製序列、著絲粒和位於兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅動染色體的複製和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。圖3-27描繪了 YAC 載體的原理性工作流程。對於BamHⅠ切割後形成的微型酵母染色體，當用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因 sup4 內部的位點後形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉化進入到酵母菌後可象染色體一樣複製，並隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的。裝載了外源 DNA 片段的重組子導致抑制基因 sup4 插入失活，從而形成紅色菌落； 而載體自身連線後轉入到酵母細胞後形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達 200-500kb，有的可達 1Mb 以上，甚至達到 2Mb 。
YAC 載體功能強大，但有一些弊端。這主要表現在 3 個方面：首先，在 YAC 載體的插入片段會出現缺失（deletion） 和基因重排（rearrangement） 的現象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個 YAC 中的插入片段由 2 個或多個的獨立基因組片段連線組成。嵌合克隆約占總克隆的 5%～50% 。最後， YAC 染色體與宿主細胞的染色體大小相近，影響了 YAC 載體的廣泛套用。 YAC 染色體一旦進入釀酒酵母細胞，由於其大小與內源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利於進一步分析。但是 YAC 的一個突出優點是，酵母細胞比大腸桿菌對不穩定的、重複的和極端的 DNA 有更強的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由於高等真核生物的基因大多數是多外顯子結構並且有長長的內含子，大型基因組片段可通過 YAC 載體轉移到動物或動物細胞系中，進行功能研究。
研究現狀
2014年，Sc2.0已創建了一個單一的人工酵母染色體。
2017年3月10日出版的國際頂級學術期刊《科學》，以封面的形式同時刊發了中國科學家完成的4條真核生物釀酒酵母染色體的從頭設計與化學合成的4篇研究長文。中外科學家們共完成了5條染色體的化學合成，其中中國科學家完成了4條，占完成數量的66.7%，把Sc2.0計畫向前推進了一大步。由天津大學、清華大學和華大基因分別完成的這4篇長文，突破了生物合成方面的多項關鍵核心技術，比如：突破合成型基因組導致細胞失活的難題，設計構建染色體成環疾病模型，開發長染色體分級組裝策略，證明人工設計合成的基因組具有可增加、可刪減的靈活性等。
其中，元英進帶領的天津大學團隊完成了5號、10號（synV、synX）染色體的化學合成，並開發了高效的染色體缺陷靶點定位技術和染色體點突變修復技術；戴俊彪研究員帶領清華大學團隊完成了當前已合成染色體中最長的12號染色體（synXII）的全合成；深圳華大基因研究院團隊聯合英國愛丁堡大學團隊完成了2號染色體（synII）的合成及深度基因型－表型關聯分析。
“5號染色體”文章第一作者、天津大學博士生謝澤雄說，在全面推進Sc2.0計畫的過程中，他們建立了基於多靶點片段共轉化的基因組精確修復技術和DNA大片段重複修復技術，解決了超長人工DNA片段的精準合成難題。同時，首次實現了真核人工基因組化學合成序列與設計序列的完全匹配，系統性支撐與評價了當前真核生物的設計原則。該技術的突破為研究人工設計基因組的重新設計、功能驗證與技術改進奠定了基礎。利用化學合成的酵母5號染色體定製化建立了一組環形染色體模型，通過人工基因組中設計的特異性水印標籤實現對細胞分裂過程中染色體變化的追蹤和分析，為研究當前無法治療的環形染色體疾病、癌症和衰老等發生機理和潛在治療手段提供了了研究模型。此外，發展了多級模組化和標準化基因組合成方法，創建了一步法大片段組裝技術和並行式染色體合成策略，實現了由小分子核苷酸到活體真核染色體的定製精準合成。”
清華大學的戴俊彪團隊，則設計合成了12號染色體。在研究中，他們開發了長染色體分級組裝的策略，即：首先通過大片段合成序列，在6個菌株中分別完成了對染色體不同區域內源DNA的逐步替換；然後利用酵母減數分裂過程中同源重組的特性，將多個菌株中的合成序列進行合併，獲得完整的合成型染色體。針對12號染色體上存在的高度重複的核糖體RNA編碼基因簇進行刪除及工程化改造，並利用修改後的重複單元在基因組多個位點重建了核糖體RNA編碼基因簇。“該工作奠定了未來對其他超大、結構超複雜的基因組進行設計與編寫的基礎，同時也證明了酵母基因組中rDNA（核糖體DNA）區域及其他序列均具有驚人的靈活度與可塑性。”戴俊彪表示。
深圳華大基因研究院與英國愛丁堡大學共同完成2號染色體的從頭設計與全合成（長770 Kb），合成酵母菌株展現出與野生型高度相似的生命活性。
現實意義
釀酒酵母是第一個被全基因組測序的真核生物，大尺度的設計和重建酵母基因組是對目前酵母領域知識貯備的真實性、完整性和準確性的一個直接考驗。化學合成酵母，一方面可以幫助人類更深刻地理解一些基礎生物學的問題，另一方面可以通過基因組重排系統，使酵母實現快速進化，得到在醫藥、能源、環境、農業、工業等領域有重要套用潛力的菌株。
合成生物學（Synthetic Biology）是繼“DNA雙螺旋發現”和“人類基因組測序計畫”之後，以基因組設計合成為標誌的第三次生物技術革命。生物學界內最重要的分類依據，既不是植物和動物，也不是多細胞和單細胞生物，而是以原核生物和真核生物來區分。細菌、病毒等原核生物的基因組相對簡單，而動物、植物、真菌等等真核生物的基因（DNA）既豐富又複雜，通常會包含數億至甚至數十億鹼基對信息。同時，作為遺傳物質的DNA通常被分配到不同的染色體中，而這些染色體又深藏在細胞核的特定區域。所以，合成一個真核生物的基因組是一項非常艱巨的任務。但是，如果生物學真正做到引領技術革命，合成真核生物基因組技術必將發揮非常核心的作用。如果說病毒基因組的合成開啟了基因組化學合成研究，那么原核生物和真核生物基因組合成研究的不斷突破，則初步實現了化學全合成基因組對單細胞原核生物和真核生物的生命調控。
