酵母人工染色體（YAC）： 將四膜蟲的端粒與酵母的部分染色體（包括CEN、ARS）拼接起來再導入酵母細胞。
酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomes YACs）
YAC 人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的複製元件構建的載體，其工作環境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。
1．YAC人工染色體載體的複製元件和標記基因
在 YAC 載體中最常用的是 pYAC4 。由於酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態也是線狀的。但是，為了方便製備YAC載體， YAC 載體以環狀的方式存在，並增加了普通大腸桿菌質粒載體的複製元件和選擇標記，以便保存和增殖。
YAC 載體的複製元件是其核心組成成分，其在酵母中複製的必需元件包括複製起點序列即自主複製序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用於有絲分裂和減數分裂功能的著絲粒 （centromere , CEN）和兩個端粒（TEL）。
YAC 載體為能夠滿足自主複製、染色體在子代細胞間的分離及保持染色體穩定的需要，必須含有以下元件：
·端粒重複序列（telomeric repeat ， TEL）：定位於染色體末端一段序列，用於保護線狀的 DNA 不被胞內的核酸酶降解，以形成穩定的結構。
·著絲粒（centromere ， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點， 使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中 。在 YAC 中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。
·自主複製序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向複製所必須的信號。
YAC 載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在於細胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象，可用於篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。
2．YAC 載體的工作原理
YAC 載體主要是用來構建大片段 DNA 文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，並不用作常規的基因克隆。圖3-26是 pYAC4 的遺傳結構圖，當用 BamHⅠ 切割成線狀後，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體複製的必要順式元件，如自主複製序列、著絲粒和位於兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅動染色體的複製和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。圖3-27描繪了 YAC 載體的原理性工作流程。對於 BamHⅠ切割後形成的微型酵母染色體，當用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 內部的位點後形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉化進入到酵母菌後可象染色體一樣複製，並隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的。裝載了外源 DNA 片段的重組子導致抑制基因 sup4 插入失活，從而形成紅色菌落； 而載體自身連線後轉入到酵母細胞後形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達 200-500kb，有的可達 1Mb 以上，甚至達到 2Mb 。
YAC 載體功能強大，但有一些弊端。這主要表現在 3 個方面：首先，在 YAC 載體的插入片段會出現缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的現象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個 YAC 中的插入片段由 2 個或多個的獨立基因組片段連線組成。嵌合克隆約占總克隆的 5%～50% 。最後， YAC 染色體與宿主細胞的染色體大小相近，影響了 YAC 載體的廣泛套用。 YAC 染色體一旦進入釀酒酵母細胞，由於其大小與內源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利於進一步分析。但是 YAC 的一個突出優點是，酵母細胞比大腸桿菌對不穩定的、重複的和極端的 DNA 有更強的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由於高等真核生物的基因大多數是多外顯子結構並且有長長的內含子，大型基因組片段可通過 YAC 載體轉移到動物或動物細胞系中，進行功能研究。
