·自主複製序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向複製所必須的信號。
YAC 載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在於細胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象，可用於篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。
YAC 載體的工作原理
YAC 載體主要是用來構建大片段 DNA 文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，並不用作常規的基因克隆。當用 BamHⅠ 切割成線狀後，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體複製的必要順式元件，如自主複製序列、著絲粒和位於兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅動染色體的複製和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。對於 BamHⅠ切割後形成的微型酵母染色體，當用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 內部的位點後形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉化進入到酵母菌後可象染色體一樣複製，並隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的。裝載了外源 DNA 片段的重組子導致抑制基因 sup4 插入失活，從而形成紅色菌落； 而載體自身連線後轉入到酵母細胞後形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達 200-500kb，有的可達 1Mb 以上，甚至達到 2Mb 。YAC 載體功能強大，但有一些弊端。這主要表現在 3 個方面：首先，在 YAC 載體的插入片段會出現缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的現象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個 YAC 中的插入片段由 2 個或多個的獨立基因組片段連線組成。嵌合克隆約占總克隆的 5%～50% 。最後， YAC 染色體與宿主細胞的染色體大小相近，影響了 YAC 載體的廣泛套用。 YAC 染色體一旦進入釀酒酵母細胞，由於其大小與內源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利於進一步分析。但是 YAC 的一個突出優點是，酵母細胞比大腸桿菌對不穩定的、重複的和極端的 DNA 有更強的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由於高等真核生物的基因大多數是多外顯子結構並且有長長的內含子，大型基因組片段可通過 YAC 載體轉移到動物或動物細胞系中，進行功能研究。
細菌人工染色體載體
（Bacterial artificial chromosomes，BACs）
1．F 質粒
大腸桿菌的 F 因子是一個約 100kb 的質粒。它編碼60多種參與複製、分配和接合過程的蛋白質（Willetts and Skurray，1987）。雖然F因子通常以雙鏈閉環DNA（1-2個拷貝/細胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個位點處進行隨機整合（Low，1987）。攜帶F因子的細胞，或以游離狀態或以整合狀態表達三根發樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產生性接觸所必需。
細菌人工染色體
是基於大腸桿菌的 F 質粒構建的，高通量低拷貝的質粒載體。每個環狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來源於大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的複製子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個易於 DNA 複製的由 ATP 驅動的解旋酶（ （RepE） 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。第一代 BAC 載體 （Shizuya et al. 1992） 不含那些能夠用於區分攜帶重組子的抗生素抗性細菌菌落與攜帶空載體的細菌菌落的標記物。新型的 BAC 載體可以通過α互補的原理篩選含有插入片段的重組子，並設計了用於回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位點和用於克隆 DNA 測序的 Sp6 啟動子、 T7 啟動子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not Ⅰ 識別序列，位點十分稀少。重組子通過 Not Ⅰ 消化後，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是來源於噬菌體的啟動子，用於插入片段末端測序。圖 3-28 是 pBeloBAC11 遺傳結構圖。
F 質粒能夠編碼形成性菌的蛋白，通過大腸桿菌的結合轉移可以進行遺傳物質的轉移。但是基因操作的時候一般不用這種自發的轉化方式。 BAC 載體空載時大小約 7.5kb ，在大腸桿菌中以質粒的形式複製，具有一個氯黴素抗性基因。外源基因組 DNA 片段可以通過酶切、連線克隆到 BAC 載體多克隆位點上，通過電穿孔的方法將連線產物導入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源 DNA 後的重組質粒通過氯黴素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互補篩選。
三、P1 噬菌體載體和 P1 人工染色體載體
P1 噬菌體載體
（Bacteriophage P1 vectors）
是 Sternberg 基於 P1 噬菌體構建的，與黏粒載體工作原理比較相似的一種高通量載體。它含有很多 P1 噬菌體來源的順式作用元件，能容納 70～100kb 大小的基因組DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在這種系統中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中，後者總容量可達 115kb （包括載體和插入片段）。將重組 DNA 注射到表達 Cre 重組酶的大腸桿菌中，線狀 DNA 分子通過重組於載體的兩個 loxP 位點之間而發生環化。另外，載體還攜帶一個通用的選擇標記 kan r ，一個區分攜帶外源 DNA 克隆的陽性標記 sacB 以及一個能夠使每個細胞都含有約一個拷貝環狀重組質粒的 P1 質粒複製子。另一個 P1 複製子（ P1 裂解性複製子）在可誘導的 lac 啟動子（IPTG 誘導）控制下，用於 DNA 分離前質粒的擴增。圖 3-29 是 P1 噬菌體載體 pAd10sacBII 的遺傳結構圖。2．P1 人工染色體（P1 artificial chromosomes）
人工染色體
染色體
人工染色體
人工染色體