電穿孔（Electroporation）也叫電轉染，是通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術可以將核苷酸、DNA 與RNA、蛋白、糖類、染料及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。電轉化相對其它物理和化學轉化方法，是一種有價值和有效的替代方法。
電穿孔是功能強大的將核酸、蛋白及其它分子導入多種細胞的高效技術。
基本介紹
- 中文名：電穿孔
- 外文名：Electroporation
- 別稱：電轉染，電滲透
- 領域：醫學
簡介,實驗室實踐,醫療套用,不可逆的電穿孔,藥物和基因傳遞,物理機制,
簡介
電穿孔或電滲透是微生物學技術，其中將電場施加到細胞以增加細胞膜的滲透性，從而允許化學品，藥物或DNA被引入細胞。在微生物學中，電穿孔過程通常用於通過引入新的編碼DNA來轉化細菌，酵母或植物原生質體。如果細菌和質粒混合在一起後，質粒可以在電穿孔後轉移到細菌中，儘管取決於正在轉移的細胞穿透肽或CellSqueeze也可以被使用。電穿孔通過在電穿孔比色杯（1.0-1.5kV，250-750V / cm）中傳遞數千伏特穿過1-2毫米懸浮細胞的距離而起作用。之後，細胞必須小心處理，直到它們有機會分裂，產生含有再生質粒的新細胞。這一過程比化學轉化效率大約高出十倍。
電穿孔對於將外源基因導入組織培養細胞，特別是哺乳動物細胞也是高效的。例如，它被用於生產敲除小鼠的過程中，以及在腫瘤治療，基因治療和基於細胞的治療中。將外源DNA導入真核細胞的過程稱為轉染。電穿孔對於使用電穿孔比色皿轉染懸浮液中的細胞是非常有效的。電穿孔已經被證明有效用於體內組織，用於子宮內套用以及卵內轉染。貼壁細胞也可以被轉染使用電穿孔，為研究人員提供了一種替代方案，在轉染前將其細胞進行胰蛋白酶消化。然而，電穿孔的一個缺點是在這個過程之後，超過7000個基因的基因表達可能受到影響。這可能會導致研究中的基因表達必須控制，以確保準確和精確的結果的問題。
細胞融合不僅是細胞生物學中一個必不可少的過程，而且作為生物技術和醫學的一種有用的方法。人工誘導融合可用於研究和治療不同的疾病，如糖尿病再生中樞神經系統的軸突並產生具有所需特性的細胞，例如用於癌症免疫治療的細胞疫苗。然而，細胞融合的第一和最公知的套用是生產雜交瘤技術，其中雜交細胞系（雜交瘤）由融合特異性的產生抗體的B淋巴細胞與骨髓瘤形成的單克隆抗體（ B淋巴細胞癌）細胞系。
實驗室實踐
圖1 用於電穿孔的比色杯電穿孔是用電穿孔器，在細胞溶液中產生靜電場的專用器具進行的。將細胞懸浮液被吸取到一具有兩個鋁玻璃或塑膠比色皿電極在其兩側。對於細菌電穿孔，通常使用約50微升的懸浮液。在電穿孔之前，將這種細菌懸液與質粒混合被改變。將混合物移液到比色杯中，設定電壓和電容，並將比色杯插入電穿孔儀中。該過程需要電極和懸架之間的直接接觸。在電穿孔後立即將1毫升液體培養基加入到細菌中（在比色杯中或在Eppendorf管中），並將細菌在細菌的最佳溫度下孵育1小時或更長時間以使細胞恢復並表達質粒，隨後在瓊脂平板上細菌培養。
電穿孔的成功很大程度上取決於質粒溶液的純度，特別是其鹽含量。高鹽濃度的溶液可能會導致放電（稱為電弧放電），這往往會降低細菌的活力。對於該方法的進一步的詳細調查，更應注意的輸出阻抗的穿孔器裝置和所述輸入阻抗的細胞懸浮液（例如鹽含量）。
由於細胞膜不能通過電流（離子通道除外），所以它起電容器的作用。對膜進行高壓電場導致其暫時分解，導致孔大到足以使大分子（如DNA）進入或離開電池。
醫療套用
不可逆的電穿孔
在Gustave Roussy研究所，由Lluis M Mir領導的第一批研究醫療套用的電穿孔。在這種情況下，他們研究了使用可逆電穿孔與不可滲透的大分子。東維吉尼亞醫學院和奧多明尼昂大學的研究人員首先研究了如何在人類細胞上使用納秒脈衝，並於2003年出版。
關於不可逆的電穿孔，2007年，一組科學家在13隻小鼠中有12隻實現了完全的腫瘤消融，成功治療了第一個成功治療小鼠惡性皮膚腫瘤。他們通過傳送80微秒的0.3微秒，電場幅度為2500伏/厘米的80微秒脈衝來治療皮膚腫瘤。
在豬中發現了更高的電穿孔電壓，以在不大的範圍內不可逆轉地破壞靶細胞，同時使相鄰細胞不受影響，因此代表了癌症，心臟病和其他需要去除組織的疾病的有希望的新療法。不可逆電穿孔（IRE）自被證明能有效治療人類癌症，與外科醫生約翰霍普金斯大學和其他機構現在採用該技術治療胰腺癌以前被認為是不可切除的。
最近被稱為非熱不可逆電穿孔（N-TIRE）的技術在治療許多不同類型的腫瘤和其他不需要的組織方面被證明是成功的。使用小電極（直徑約1mm）完成該過程，放置在目標組織的內部或周圍，以預定的電壓和頻率施加短暫的重複性電爆發。這些電力爆發增加了靜息跨膜電位（TMP），使納米孔在質膜中形成。當施加到組織的電力高於目標組織的電場閾值時，細胞從納米孔的形成永久地滲透。結果，細胞無法修復由於體內平衡的喪失而造成的損傷並死亡。N-TIRE對於其他腫瘤消融技術是獨特的，因為它不會對其周圍的組織造成熱損傷。
相反，當施加電極的電力低於目標組織的電場閾值時，發生可逆電穿孔。由於施加的電量低於細胞的閾值，它允許細胞修復其磷脂雙分子層並繼續其正常的細胞功能。可逆性電穿孔通常通過涉及使藥物或基因（或其他通常不能透過細胞膜的分子）進入細胞的治療來完成。並非所有的組織都具有相同的電場閾值;因此需要在治療前仔細計算以確保全全性和有效性。
使用N-TIRE的一個主要優點是，如果按照仔細的計算正確完成，它只會影響目標組織。蛋白質，細胞外基質，以及諸如血管和神經的關鍵結構都不受影響，並且通過該處理保持健康。這允許更快的恢復，並且促進用健康細胞更快速地替換死亡的腫瘤細胞。
在做這個手術之前，科學家們必須仔細計算需要做什麼，並且在每個病例的基礎上對待每個病人。為此，通常使用諸如CT掃描和MRI的成像技術來創建腫瘤的3D圖像。根據這些信息，他們可以近似腫瘤體積，並使用軟體技術決定最佳的療程，包括電極插入位置，插入角度，所需電壓等等。通常情況下，CT機器將被用於在手術期間幫助放置電極，特別是當電極用於治療大腦中的腫瘤時。
整個過程非常快，通常需要大約五分鐘。這些手術的成功率很高，對未來的人類治療非常有前景。使用N-TIRE的一個缺點是從電極輸送的電能刺激肌肉細胞收縮，根據情況可能具有致命的後果。因此，執行程式時必須使用癱瘓代理人。這種研究中使用的麻痹劑是成功的;然而，使用麻醉劑時總會有一些風險，雖然很小。
已經開發了更新的技術，稱為高頻不可逆電穿孔（H-FIRE）。該技術使用電極以高頻率施加雙極性電力突發，而不是以低頻率單極性爆發電力。這種手術與N-TIRE具有相同的腫瘤消融成功率。然而，它有一個明顯的優勢，H-FIRE不會導致病人肌肉收縮，因此不需要麻痹劑。
藥物和基因傳遞
電穿孔還可以用於通過施加瞬時透化細胞膜的短且強烈的電脈衝來幫助將藥物或基因遞送到細胞中，從而允許運輸分子，否則不能通過細胞膜運輸。當待輸送的分子是DNA時，這個過程被稱為電化學療法，當待輸送的分子是化學治療劑或基因電轉移時。來自卡羅林斯卡研究所和牛津大學的科學家使用外來體的電穿孔在全身注射（在血液中）後將siRNA，反義寡核苷酸，化學治療劑和蛋白質特異性地遞送給神經元。由於這些外泌體能夠穿過血腦屏障，該方案可以解決向中樞神經系統遞送藥物差的問題，並治癒阿爾茨海默病，帕金森病和腦癌等疾病。
物理機制
脂雙層力學
電穿孔允許細胞引入高度帶電荷的分子，例如不會被動地擴散穿過疏水性雙層核心的DNA。這一現象表明，該機制是在膜上形成納米級的充水空穴。雖然電穿孔和介電擊穿這兩者都是由電場的套用引起的，所涉及的機制是根本不同的。在電介質擊穿中，阻擋材料被電離，產生導電通路。材料的變化因此是化學性質的。相比之下，在電穿孔過程中，脂質分子不是化學改變的，而是簡單地移動位置，打開一個孔，充當水時充當通過雙層的導電通路。
電穿孔是一種動態現象，取決於細胞膜上每個點的局部跨膜電壓。一般認為，對於給定的脈衝持續時間和形狀，存在特定的跨膜電壓閾值用於電穿孔現象的表現（從0.5V到1V）。這導致電穿孔的電場量值閾值（Eth）的定義。也就是說，只有其中E≧Ë區域內的細胞日電穿孔。如果達到或超過第二閾值（Eir），則電穿孔將損害細胞的生存力，即不可逆電穿孔（IRE）。
圖2 中顯示了疏水孔（頂部）和親水孔（底部）中的脂質的理論排列。
電穿孔是具有幾個不同階段的多步驟過程。首先，將短的電脈衝，必須套用。典型的參數是300-400 mV，跨越膜的時間小於1 ms（注意：電池實驗中使用的電壓通常要大得多，因為它們被用於跨越大體積溶液的較大距離，所以橫跨實際膜的結果場只是所施加的偏差的一小部分）。在施加這個電位時，膜像電容器一樣充電通過周圍溶液中的離子遷移。一旦達到臨界場，就會在脂質形態上發生快速的局部重排。所得到的結構被認為是“預孔”，因為它不導電，但很快導致產生導電孔。這些前毛孔存在的證據主要來自毛孔的“閃爍”，這表明導電和絕緣狀態之間的轉換。已經提出，這些預製孔是小的（〜3）疏水性缺陷。如果這個理論是正確的，那么過渡到導電狀態可以通過在孔邊緣的重排來解釋，其中脂質頭部摺疊以形成親水界面。最後，這些導電孔可以癒合，重新密封雙層或擴大，最終破裂。由此得出的結論取決於是否超過了臨界缺陷尺寸，這又取決於所施加的場，局部機械應力和雙層邊緣能量。
