血液、體液、分泌物、糞便等宿主來源並包含病毒的物質稱病料，病毒分離時，傳代細胞系、原代細胞是常用的分離方法，動物接種、雞胚接種必要時也可用於病毒分離。分離成功的病毒，首選細胞培養的方式進行擴增，動物、雞胚和組織也可用於病毒擴增培養，培養後的純病毒可用於鑑定、分型、感染特性和致病特性等研究。
基本介紹
- 中文名：病毒分離培養鑑定
- 臨床意義：是診斷病毒感染的“金標準”
檢查前準備,操作方法,臨床意義,
檢查前準備
不同病毒嗜好不同組織，相同病毒不同感染時期也有不同的組織和細胞分布，取材應結合病程和病情。常用標本有血液、咽洗液、鼻咽拭子、糞便、腦脊液、水皰液、眼洗液、結膜拭子等。
1.病程中期較早期和晚期易分離到病毒，病料採集時應適當考慮時間。
2.不同病毒在不同組織中含量不同，局部感染時可取部分組織或灌洗液，全身感染或隱匿感染時可取血液，中樞神經感染時取腦脊液。
3.樣本留取時應儘量無菌，如因樣本來源、操作等原因無法避免細菌污染時應對標本進行特殊處理。
4.標本需要儘快送檢，如不能在1小時內送至檢測機構需凍存於-20℃，轉運時應避免反覆凍融。
1.病程中期較早期和晚期易分離到病毒，病料採集時應適當考慮時間。
2.不同病毒在不同組織中含量不同，局部感染時可取部分組織或灌洗液，全身感染或隱匿感染時可取血液，中樞神經感染時取腦脊液。
3.樣本留取時應儘量無菌，如因樣本來源、操作等原因無法避免細菌污染時應對標本進行特殊處理。
4.標本需要儘快送檢，如不能在1小時內送至檢測機構需凍存於-20℃，轉運時應避免反覆凍融。
操作方法
1.去除污染
糞便、鼻咽拭子及其他暴露在外環境中的標本，因攜帶細菌、真菌和其他病原體，接種前需進行特殊處理，首先對稀釋後樣本進行高速離心以去除固體沉澱和部分大分子物質，對離心後的上清添加適量抗生素和抗真菌藥物以減少細菌和真菌的生長，最後採用合適孔徑的濾膜過濾去除細菌等污染物獲得病毒懸液。
2.樣本處理和保存
首先將材料用無菌剪分成小塊，置於無菌的碾缽內儘量磨碎，較軟的腦、脊髓等組織可用勻漿器打碎，研磨完全後凍融1～3次，加適量生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水或病毒培養基並添加適量抗生素製成病毒懸液，離心後取上清，必要時還可用濾液接種敏感細胞，如不能及時接種，應添加防凍液置-80℃冰櫃或液氮保存。
3.檢驗方法
（1）動物接種：動物活體對病毒的感染率取決於對該病毒是否敏感、病毒接種量、接種部位以及病毒毒力等因素。宿主為人類的病毒接種時最好選擇進化最接近人的物種如猩猩、獼猴、狒狒等。由於經濟、倫理等因素，實驗室常用的動物多為大鼠、小鼠、豚鼠和小豬等。接種部位可分口服灌胃、皮下、腹腔、血管內和顱內注射等。
（2）雞胚接種： 雞胚由於分化程度相對較低，來源充足且造價經濟常用於某些敏感病毒的培養，不同的病毒接種於不同的囊腔中，經過孵育後可獲得大量病毒，常用於病毒的分離、培養、增毒、抗原和疫苗製備等。
（3）細胞培養：是病毒培養最常用的方法，根據病毒的細胞嗜性，選擇合適的原代細胞或細胞系進行接種。培養時根據病毒的生長特性可添加適量的生長因子、血清、胰酶等物質。烈性病毒接種後的致細胞病變作用（CPE）可作為病毒感染細胞的直接觀察指標，如CPE不明顯，則需通過PCR（聚合酶鏈反應）、WB（蛋白印跡Western blotting）和IF（免疫螢光）等方法鑑定病毒是否感染細胞。適應了細胞培養的病毒生長良好，可進行連續傳代。
4.病毒的鑑定
臨床來源的病料在接種前通常會對病毒進行初步鑑定，常用方法包括ELISA（酶聯免疫吸附試驗）以及PCR測序等，獲得純培養的病毒則需要進行再次鑑定以確保病毒的正確性，常用PCR測序、IF和WB等。根據臨床症狀、標本來源及細胞病變等特性鑑定病毒具有較大的誤差，病毒的核酸、蛋白作為鑑定依據較準確。
糞便、鼻咽拭子及其他暴露在外環境中的標本，因攜帶細菌、真菌和其他病原體，接種前需進行特殊處理，首先對稀釋後樣本進行高速離心以去除固體沉澱和部分大分子物質，對離心後的上清添加適量抗生素和抗真菌藥物以減少細菌和真菌的生長，最後採用合適孔徑的濾膜過濾去除細菌等污染物獲得病毒懸液。
2.樣本處理和保存
首先將材料用無菌剪分成小塊，置於無菌的碾缽內儘量磨碎，較軟的腦、脊髓等組織可用勻漿器打碎，研磨完全後凍融1～3次，加適量生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水或病毒培養基並添加適量抗生素製成病毒懸液，離心後取上清，必要時還可用濾液接種敏感細胞，如不能及時接種，應添加防凍液置-80℃冰櫃或液氮保存。
3.檢驗方法
（1）動物接種：動物活體對病毒的感染率取決於對該病毒是否敏感、病毒接種量、接種部位以及病毒毒力等因素。宿主為人類的病毒接種時最好選擇進化最接近人的物種如猩猩、獼猴、狒狒等。由於經濟、倫理等因素，實驗室常用的動物多為大鼠、小鼠、豚鼠和小豬等。接種部位可分口服灌胃、皮下、腹腔、血管內和顱內注射等。
（2）雞胚接種： 雞胚由於分化程度相對較低，來源充足且造價經濟常用於某些敏感病毒的培養，不同的病毒接種於不同的囊腔中，經過孵育後可獲得大量病毒，常用於病毒的分離、培養、增毒、抗原和疫苗製備等。
（3）細胞培養：是病毒培養最常用的方法，根據病毒的細胞嗜性，選擇合適的原代細胞或細胞系進行接種。培養時根據病毒的生長特性可添加適量的生長因子、血清、胰酶等物質。烈性病毒接種後的致細胞病變作用（CPE）可作為病毒感染細胞的直接觀察指標，如CPE不明顯，則需通過PCR（聚合酶鏈反應）、WB（蛋白印跡Western blotting）和IF（免疫螢光）等方法鑑定病毒是否感染細胞。適應了細胞培養的病毒生長良好，可進行連續傳代。
4.病毒的鑑定
臨床來源的病料在接種前通常會對病毒進行初步鑑定，常用方法包括ELISA（酶聯免疫吸附試驗）以及PCR測序等，獲得純培養的病毒則需要進行再次鑑定以確保病毒的正確性，常用PCR測序、IF和WB等。根據臨床症狀、標本來源及細胞病變等特性鑑定病毒具有較大的誤差，病毒的核酸、蛋白作為鑑定依據較準確。
臨床意義
從病料中成功進行病毒的分離培養和鑑定是診斷病毒感染的“金標準”。雖然並不是所有病毒性疾病的診斷都需作病毒分離，但是若新疾病流行、血清學檢測產生交叉反應、兩種病毒無法區別，需進一步確診且同一症狀的疾病可能由多種病毒引起，則需要分離病毒。病毒的分離與鑑定對監測流行病的新動向、研究新疾病、新病毒以及疫苗的研發都有重要作用。
