無血清培養基

無血清培養基和試劑被廣泛的套用於培養哺乳動物和無脊椎動物細胞以製備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數的無血清培養基含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質和清蛋白，纖維蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養中發揮各種不同的功能，如提供細胞貼壁所需的基質，抗生物反應器剪下力，作為脂質和其他生長分化因子的載體等。

基本介紹

• 中文名：無血清培養基
• 添加組分：促貼壁物質、促生長因子及激素等
• 優點：有利於體外培養細胞的分化
• 缺點：成本較高

定義

無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。

無血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。 用於生物製藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由於缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

添加組分

1.促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2.促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

3.酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

4.結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常見的。

使用方法

目前，血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以後，再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗後這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養於無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養於含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化。

為了使細胞適應無血清培養，關鍵的是使所培養細胞：

1.處於對數生長中期

2.>90% 活細胞率

3.適應時以較高的起始細胞接種

細胞適應無血清培養基的方法

1.直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對於直接適應，接種細胞密度應該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

2.連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對於細胞更加溫和一些。

（1）以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25%SFM 混合培養基中，傳代培養。

（2）當細胞密度>5×10細胞/ml時，以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

（3）以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，25%有血清培養基和75% SFM中傳代培養。

（4）當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml（接種後4到6天），在100%SFM培養基中傳代培養。

（5）每隔3到5天，當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易於受外界因素的影響。

細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培養基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。

培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同於FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配製無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水淨化裝置製備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

無血清培養基的優點

1.可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重複性。

2.避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清組分對實驗研究的影響。

4.有利於體外培養細胞的分化。

5.可提高產品的表達水平並使細胞產品易於純化。

缺點：

1.細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和套用不如傳統的合成培養基方便。

2.成本較高。

3.針對性很強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

無血清培養基一些配方

1.神經細胞，幹細胞，PC12細胞

成份 終濃度

葡萄糖－－0.6%

谷氨醯胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰島素－－2.5μg/ml

轉鐵蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸鈉－－30nM

青黴素－－50mg/ml

鏈黴素－－50mg/ml

最後用DF12添加到100ml即可

2.各類小鼠胚胎癌細胞系培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO₃2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纖粘連蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分鐘）

胰島素 1000.0ug

轉鐵蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纖維細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制劑 0.1%

胰島素 10.0ug/ml

轉鐵蛋白 25.0ug/ml

纖粘連蛋白 5.0ug/ml

4.雜交瘤細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO₃1.2g/L

HEPES 15mM

胰島素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

轉鐵蛋白 35.5ug/ml

套用：無血清培養基和試劑被廣泛的套用於培養哺乳動物和無脊動物細胞以製備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數的無血清產品含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養中發揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應器剪下力，提供細胞貼壁所需的基質，作為脂類和其他生長因子的載體等。

無血清培養基的種類

LONZA公司 無血清培養基

UltraCULTURETM培養劑

12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium) 500ml

產品簡介：一種通用的無血清培養劑

適用範圍：培養貼壁和懸浮哺乳動物細胞，疫苗生產中病毒顆粒的製備

PC-1TM培養基

產品：

77232 PC-1Complete Serum-free Medium 500ml

77230 PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement) 10L

344022 PC-1 Supplement (50) 10ml

產品簡介：是一種低蛋白，無血清培養基。PC-1培養基旨在套用於各種研究和工業用途，使用限定成份配製的培養基確保在維持最低蛋白成分同時使細胞獲得最佳的生長狀態。

適用範圍：培養原代細胞和貼壁依賴性細胞

UltraMEM Reduced Serum培養基

產品：

12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES) 500ml

12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Protein-free basal medium without L-glutamine) 500ml

產品簡介：用於支持多種貼壁信賴性細胞在低血清濃度下的正常生長的限定培養基。

適用範圍：培養貼壁信賴性細胞

UltraCHOTM培養基

產品：

12-724Q UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L

12-715F UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL

17-811A UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml

產品簡介：培養基最適於培養轉染和未轉染的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞，表達重組蛋白質。

適用範圍：培養CHO細胞; 重組蛋白的合成。

UltraMDCKTM培養基

產品：12-749Q UltraMDCK Meida 1L

產品簡介：是一種無血清限定培養劑，適於高/低平板密度培養MADIN-DABBY犬腎細胞（MDCK）

適用範圍：培養供體外診斷（IVD）用的MDCK細胞

Pro293TMCDM系統

產品：

12-764Q PRO 293A-CDM 1L

12-765Q PRO 293S-CDM 1L

產品簡介：用於293細胞（轉化的人胚腎細胞）培養Pro293限定培養基系統是專為促進293細胞重組蛋白的合成和下游反應而開發的。這些配方不需要任何動物來源的成分即可支持高密度的培養

適用範圍：293細胞重組蛋白和合成

Insect-XPRESSTM培養基

產品：12-730Q Insect-XPRESS Medium 1L

產品簡介：採用一種無蛋白配方，適合培養來源於Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆蟲細胞系。

適用範圍：桿狀病毒的增殖，重組蛋白的表達。

HL-1TM完全無血清培養基

產品：77203 HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L

產品簡介：HL-1TM完全無血清培養基是一種限定培養基，蛋白含量低於30ug/ml. HL-1TM完全無血清培養基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。

適用範圍：雜交瘤細胞和淋巴細胞來源的分化細胞的無血清培養。

UltraDOMATM 培養基

產品：12-723 BUltraDOMA Medium 500ml

產品簡介：適用於中空纖維反應器中進行中，鼠和嵌合雜交瘤細胞的培養及上述細胞的批量培養。

適用範圍：雜交瘤細胞的培養，單克隆抗體的製備。

UltraDOMA-PF 無蛋白培養基

產品：12-727F FUltraDOMA-P.F.Protein-free Medium 500ml

08-024B Ultra DOMA-P.F.Protein-free Medium 10L

產品簡介：一種不含蛋白的培養基，適於鼠，人和嵌合細胞來源的雜交瘤細胞系的培養。

適用範圍：雜交瘤細胞和骨髓瘤細胞的培養，單克隆抗體的製備。

X-VIVO培養基

X-VIVO 10

產品：

04-380Q X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-743Q X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產品簡介：為了有助於在無血清環境中製備淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)而設計的。

X-VIVO 15

產品：

04-418Q X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-744Q X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red, 1 L

產品簡介：在組成上和X-VIVO 10相似，並且經過調整最佳化使之適合於無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助於外周學及人類腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖。同時還用於維持人類單核細胞、巨噬細胞及細胞系、粒細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長。

X-VIVO 20

產品：04-448Q X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產品簡介：經過改進和最佳化有助於單核細胞耗竭的高密度的外周淋巴細胞製備LAK細胞。

價格：待定

存儲條件：2℃-8℃

三種培養的部分細胞類型套用如下：

人和鼠淋巴因子激活殺傷細胞（LAK）；外周血淋巴細胞（PBL）；人和鼠腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）；人T細胞；人和鼠巨噬細胞；人和鼠造血幹細胞（克隆形成和增殖）；人體組織的冰凍保存。

X-VIVO 產品的其他套用包括：

PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰凍保存和移植；人單核細胞和巨噬細胞的培養；幹細胞的培養；樹突狀細胞的培養。