基本介紹
- 中文名：桿狀病毒表達系統
- 亦稱：多角體病毒或顆粒體病毒
- 特點：兩類病毒體
- 性狀：單一閉合環狀雙鏈DNA分子
桿狀病毒,生物學特性,載體和發展,空斑純化,標誌基因篩選,其它方法,影響表達因素,表達體系套用,
桿狀病毒
體外基因表達系統包括原核細胞系統和真核細胞系統。原核細胞系統主要是大腸桿菌細胞系統，它操作簡便，周期短，收益大，表達產物穩定，但是表達基因的分子量有限，不宜過大，且不能對表達產物進行一些翻譯後加工作用。真核細胞系統包括COS 細胞、CHO細胞、酵母細胞和昆蟲細胞等表達系統。昆蟲細胞表達系統（即桿狀病毒表達系統）獨特的生物學特性，日益受到人們的重視。昆蟲細胞培養及操作較簡便，成本低，因此被廣泛用於生產基因工程產品。本文就該系統的特性、技術方法以及套用新進展作一綜述。
生物學特性
桿狀病毒（又稱多角體病毒或顆粒體病毒）有兩類病毒體[1]，芽殖病毒體（buded virion，BV）和多角體源性病毒體（polyhedron derived virion,PDV）。在病毒複製過程中，首先產生BV，BV核殼產生後通過芽生方式從細胞中釋放出來，再感染其它細胞，複製後期產生PDV，PDV核殼產生後在細胞核內獲得包膜，再被包被在蛋白質包含體中，直到細胞裂解後才被釋放到周圍環境中，再感染其它細胞。
桿狀病毒的基因組為單一閉合環狀雙鏈DNA分子，大小為80～160 kb，其基因組可在昆蟲細胞核內複製和轉錄。DNA複製後組裝在桿狀病毒的核衣殼內，後者具有較大的柔韌性，可以容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體。近幾十年，有關桿狀病毒基因結構、功能和表達調節的研究工作進展迅速，其中研究最多的是苜蓿銀紋夜蛾NPC(AcNPV)。該種桿狀病毒在昆蟲細胞核內複製的兩個顯著方面就是形成BV和PDV。AcNPV的基因表達分為4個階段[2]：立早期基因表達，早期基因表達，晚期基因表達和極晚期基因表達。前兩個階段的基因表達早於DNA複製，而後兩個階段的基因表達則伴隨著一系列的病毒DNA合成。其中在極晚期基因表達過程中有兩種高效表達的蛋白，它們是多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包含體的主要成分，相對分子質量約為29 000,感染後期在細胞中的累積可高達30%～50%，是病毒複製非必需成分，但對於病毒粒子卻有保護作用，使之保持穩定和感染能力。另一類高效表達的極晚期蛋白為P10蛋白，它也是一類病毒複製非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質，可能與細胞溶解有關。p10基因和多角體基因現在都已被定位、克隆和測序。這兩個基因啟動子具有較強的啟動能力，因此這兩個基因位點成為桿狀病毒表達載體系統的理想的外源基因插入位點。
桿狀病毒的基因組為單一閉合環狀雙鏈DNA分子，大小為80～160 kb，其基因組可在昆蟲細胞核內複製和轉錄。DNA複製後組裝在桿狀病毒的核衣殼內，後者具有較大的柔韌性，可以容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體。近幾十年，有關桿狀病毒基因結構、功能和表達調節的研究工作進展迅速，其中研究最多的是苜蓿銀紋夜蛾NPC(AcNPV)。該種桿狀病毒在昆蟲細胞核內複製的兩個顯著方面就是形成BV和PDV。AcNPV的基因表達分為4個階段[2]：立早期基因表達，早期基因表達，晚期基因表達和極晚期基因表達。前兩個階段的基因表達早於DNA複製，而後兩個階段的基因表達則伴隨著一系列的病毒DNA合成。其中在極晚期基因表達過程中有兩種高效表達的蛋白，它們是多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包含體的主要成分，相對分子質量約為29 000,感染後期在細胞中的累積可高達30%～50%，是病毒複製非必需成分，但對於病毒粒子卻有保護作用，使之保持穩定和感染能力。另一類高效表達的極晚期蛋白為P10蛋白，它也是一類病毒複製非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質，可能與細胞溶解有關。p10基因和多角體基因現在都已被定位、克隆和測序。這兩個基因啟動子具有較強的啟動能力，因此這兩個基因位點成為桿狀病毒表達載體系統的理想的外源基因插入位點。
載體和發展
桿狀病毒基因組十分龐大，不能直接對其進行操作插入外源基因，因此需要通過中間轉染載體而獲得重組桿狀病毒。經過十多年來研究者們的不斷探索，已構建出用於表達不同基因產物的各種轉移載體。這些轉移載體的共同特徵是[3]：①在一個基礎質粒（如pUC系列）中插入一個多角體蛋白基因啟動子（或p10基因啟動子）；②啟動子下游為一個多克隆位點區,其兩側含有與桿狀病毒多角體基因同源的側翼序列；③重組轉染載體與野生型病毒AcNPV DNA共轉染昆蟲細胞，通過多角體蛋白基因啟動子兩端的側翼同源序列與AcNPV DNA在胞內發生同源重組，使多角體基因被外源基因取代，而將外源基因整合到病毒基因組的相應位置，這樣就獲得了重組的桿狀病毒。
桿狀病毒轉染載體大致可分為下面3類；
桿狀病毒轉染載體大致可分為下面3類；
用於表達融合型蛋白的轉染質粒
是一類早期構建的轉染質粒，它包括pAC系列[4],如pAC101、pAC311、pAC360等。在每個載體中，多角體蛋白基因啟動子下游ATG啟始密碼後含有一個單一的BamHⅠ酶切位點，當外源基因和多角體基因的讀碼框架正確時，就可以獲得含1個或幾個多角體蛋白N端胺基酸的融合型外源基因。
是一類早期構建的轉染質粒，它包括pAC系列[4],如pAC101、pAC311、pAC360等。在每個載體中，多角體蛋白基因啟動子下游ATG啟始密碼後含有一個單一的BamHⅠ酶切位點，當外源基因和多角體基因的讀碼框架正確時，就可以獲得含1個或幾個多角體蛋白N端胺基酸的融合型外源基因。
用於表達單一非融合蛋白的轉染質粒
由於外加的多角體蛋白或其它的胺基酸可能對外源蛋白的生物活性或細胞定位產生影響，所以用於表達非融合型蛋白的轉移載體被廣泛套用。幾種不同的策略被用於設計高水平表達非融合蛋白的轉移載體：
(1)如pAcRP[5]系列等，都在多角體基因啟動子啟始密碼ATG上游引入一個單一的限制性多克隆位點；
(2)如pAcYM1[6]和pEV55及其衍生物中都含有所有的多角體基因上游非翻譯序列（包括啟始密碼子ATG中的A以及其後跟著的單一限制性克隆位點或多克隆位點），這樣就可以避免由於5′端非翻譯前導序列的缺失而影響mRNA的穩定性；
(3)如pVL941、pVL1392、pVL1393[7]等，是將融合載體pAC311多角體基因啟動子下游啟始密碼ATG改變為ATT。這樣，插入的外源基因必須含有自身的ATG，並從此開始翻譯，而多角體基因啟動子驅動的mRNA轉錄後產物穩定水平不受影響。
(1)如pAcRP[5]系列等，都在多角體基因啟動子啟始密碼ATG上游引入一個單一的限制性多克隆位點；
(2)如pAcYM1[6]和pEV55及其衍生物中都含有所有的多角體基因上游非翻譯序列（包括啟始密碼子ATG中的A以及其後跟著的單一限制性克隆位點或多克隆位點），這樣就可以避免由於5′端非翻譯前導序列的缺失而影響mRNA的穩定性；
(3)如pVL941、pVL1392、pVL1393[7]等，是將融合載體pAC311多角體基因啟動子下游啟始密碼ATG改變為ATT。這樣，插入的外源基因必須含有自身的ATG，並從此開始翻譯，而多角體基因啟動子驅動的mRNA轉錄後產物穩定水平不受影響。
用於表達多個非融合蛋白的轉染載體
這種載體的主要特徵是含有2個或2個以上相同的啟動子，可表達2條或2條以上多肽鏈的蛋白。
如Emery和Bishop[8]等構建的pAcVC2轉染質粒，含有兩個方向相反的多角體基因啟動子。重組病毒可同時表達多角體蛋白和淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV） N蛋白。Takehara[9]等構建了可插入兩種外源基因的雙重表達載體。該類載體也是利用兩個相同的多角體基因啟動子，使獲得的重組病毒同時表達兩種產物。Takehara等因此成功地表達了HBVsAg和HBeAg。
利用重組轉染載體與野生型AcNPV DNA共轉染細胞後獲得重組病毒的頻率是非常低的，通常只有0.2%～ 5%[10]。這樣就為篩選重組病毒的工作困難，為了提高重組效率，研究者們進行了一些探索：
（1）線性化AcNPV DNA：Kitts等[11]首先提出了將AcNPV DNA進行線性化處理。因為線性化的AcNPV DNA感染宿主細胞的能力很低，當與重組轉移質粒發生同源重組後，原來線狀的 AcNPV DNA即可自身環化，感染細胞的能力恢復，因此感染昆蟲細胞的病毒絕大多數為重組病毒，這樣使重組頻率可提高到30%；
（2）致死缺陷型病毒：由Pharmingen公司[10]推出的BaculoGoldTM系統就是一個含致死缺陷型的線性AcNPV DNA。這種系統的DNA在多角體蛋白基因下游1.7 kb範圍內的一段複製必需基因被去除，致使這種DNA轉染包裝細胞後不能複製成成熟的病毒粒子。當把重組轉染質粒與其轉染昆蟲細胞後，外源基因修復了缺失部分，病毒被復活可形成具有感染能力的病毒體，再感染其它的昆蟲細胞。這種DNA與轉染質粒的重組效率可提高到85%～99%。
這種載體的主要特徵是含有2個或2個以上相同的啟動子，可表達2條或2條以上多肽鏈的蛋白。
如Emery和Bishop[8]等構建的pAcVC2轉染質粒，含有兩個方向相反的多角體基因啟動子。重組病毒可同時表達多角體蛋白和淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV） N蛋白。Takehara[9]等構建了可插入兩種外源基因的雙重表達載體。該類載體也是利用兩個相同的多角體基因啟動子，使獲得的重組病毒同時表達兩種產物。Takehara等因此成功地表達了HBVsAg和HBeAg。
利用重組轉染載體與野生型AcNPV DNA共轉染細胞後獲得重組病毒的頻率是非常低的，通常只有0.2%～ 5%[10]。這樣就為篩選重組病毒的工作困難，為了提高重組效率，研究者們進行了一些探索：
（1）線性化AcNPV DNA：Kitts等[11]首先提出了將AcNPV DNA進行線性化處理。因為線性化的AcNPV DNA感染宿主細胞的能力很低，當與重組轉移質粒發生同源重組後，原來線狀的 AcNPV DNA即可自身環化，感染細胞的能力恢復，因此感染昆蟲細胞的病毒絕大多數為重組病毒，這樣使重組頻率可提高到30%；
（2）致死缺陷型病毒：由Pharmingen公司[10]推出的BaculoGoldTM系統就是一個含致死缺陷型的線性AcNPV DNA。這種系統的DNA在多角體蛋白基因下游1.7 kb範圍內的一段複製必需基因被去除，致使這種DNA轉染包裝細胞後不能複製成成熟的病毒粒子。當把重組轉染質粒與其轉染昆蟲細胞後，外源基因修復了缺失部分，病毒被復活可形成具有感染能力的病毒體，再感染其它的昆蟲細胞。這種DNA與轉染質粒的重組效率可提高到85%～99%。
空斑純化
標誌基因篩選
Vialard等[13]構建了一種含β-半乳糖苷酶標記的pJVNheI轉染質粒，該質粒是在多角體基因啟動子上游插入一個p10基因啟動子，由它來驅使lacZ基因表達，當這種重組轉染質粒與病毒DNA共轉染昆蟲細胞後得到的重組病毒即可在含X-gal的細胞培養物中形成藍色噬斑，使篩選工作更加容易。因此得到提示，如果先構建出含lacZ的重組病毒，在此基礎上再構建出含外源基因的重組病毒，將使篩選變得很容易。
其它方法
2003年英國University of Reading的Ian M. Jones首次通過在Bacmid上部分敲除Orf1629，構建了免空斑篩選的Bacmid。免除空斑篩選後，構建重組桿狀病毒的時間由以前的大約三周迅速降低到一周。目前採用這種策略的有OET的FlashBAC和Bacmid Ltd.的qBac.
影響表達因素
在桿狀病毒系統中，要獲得蛋白質的有效表達，首先要選擇合適的轉染載體。依據表達的蛋白質屬融合型或非融合型，選擇單啟動子型或多啟動子型。另外目的基因的選擇要注意以下因素：①該目的基因應不含內含子；②去除其mRNA 5′端非編碼區的異源序列；③翻譯啟始密碼子AUG應處於適當的序列之間（如Kozak 序列），通常認為其上游 -3位的鹼基為A時最佳；④去除mRNA 3′端的非編碼區的非必需序列；⑤若用非融合型轉移載體，基因需含自身的ATG啟始密碼，若用融合型轉移載體則不必帶上；⑥轉移載體中已含有多聚腺苷酸加尾信號，外源基因無需再帶上這類信號；⑦如果表達產物的信號肽不能被桿狀病毒表達體系有效去除時，可考慮去除這類信號肽；⑧若表達產物不能穩定表達時，可對其N端進行改造或表達融合蛋白。
除此以外，細胞的種類和生理狀態也是重組病毒繁殖的關鍵因素。蛋白質的低水平表達可能還與轉錄後加工、蛋白質轉運、以及蛋白質本身的性質相關，可以採用融合表達來解決。
除此以外，細胞的種類和生理狀態也是重組病毒繁殖的關鍵因素。蛋白質的低水平表達可能還與轉錄後加工、蛋白質轉運、以及蛋白質本身的性質相關，可以採用融合表達來解決。
表達體系套用
用桿狀病毒做載體，可高效表達外源基因，到目前為止已有幾百個包括動植物、病毒、細菌、真菌的基因在昆蟲細胞或幼蟲體內得到高效表達。這個表達體系的主要特點是可以獲得大量抗原性、免疫原性較好的，與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白。這一特點優於細菌、酵母和哺乳動物細胞表達體系。重組桿狀病毒感染昆蟲細胞後，可以對外源蛋白進行許多真核細胞的轉錄後加工作用，包括糖基化、磷酸化、醯基化、正確的信號肽切割、蛋白水解以及適當的摺疊作用，而且還可將重組蛋白聚集定位於天然蛋白的同一細胞器上，還能進行適當的寡聚化裝配。因此是表達有生物活性的蛋白質的理想載體。
由於這個載體系統獨特的性質，使其被廣泛地套用於藥物開發、疫苗、促生長因子、癌基因、抑癌基因蛋白產物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表達調控等多個領域的研究中。重組桿狀病毒的高效表達為獲得大量的類原型蛋白及其功能研究提供了可能。對於某些寡聚蛋白而言，若只表達其中某一成分並不能獲得非常好的抗原性和免疫原性，因為這些特性不僅體現在蛋白質一級結構中，而且還與蛋白質的空間構象、多個蛋白成分的相互作用有密切關係。因此，若能通過表達多個蛋白成分，並使之在特定環境中進行寡聚化裝配，獲得蛋白有效的空間構象，必然對提高免疫反應的敏感性，了解蛋白成分的相互作用極為有利。所以，近年來利用該系統表達寡聚蛋白質的研究尤其引人矚目。Roy等[14]在1996年採用桿狀病毒多啟動子表達載體成功的進行了藍舌病毒（BTV）外殼蛋白VP3、VP7、VP2、VP5的共表達，發現當VP3、VP7共表達時可形成BTV類核心顆粒，而同時表達4種成分時可形成不含病毒核酸的類病毒顆粒（VLP）。VLP的獲得對了解病毒蛋白在細胞中的裝配過程和研究各蛋白質間的相互作用奠定了基礎，更重要的是這類VLP與天然病毒粒子有極為相似的空間結構，這種特定的構象必然具有較好的抗原性和免疫原性。VLP的研究為發展有效的基因工程疫苗和敏感的診斷試劑提供了新的思路。桿狀病毒具有多種優點，是十分有發展前景的表達系統。目前，研究及套用最多的桿狀病毒系統為AcNPV，儘管它可感染30多種細胞，但主要在Sf細胞中繁殖，因此，對於其它細胞是否易感，以及外源蛋白表達水平、轉錄後加工等問題還需進行深入研究。如果在產物純化過程中有昆蟲細胞蛋白的摻入，則可能在套用時引起哺乳動物的過敏反應，因此，如何純化產物，使其導致的過敏反應降到最低限度是十分值得重視和探討的問題。
由於這個載體系統獨特的性質，使其被廣泛地套用於藥物開發、疫苗、促生長因子、癌基因、抑癌基因蛋白產物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表達調控等多個領域的研究中。重組桿狀病毒的高效表達為獲得大量的類原型蛋白及其功能研究提供了可能。對於某些寡聚蛋白而言，若只表達其中某一成分並不能獲得非常好的抗原性和免疫原性，因為這些特性不僅體現在蛋白質一級結構中，而且還與蛋白質的空間構象、多個蛋白成分的相互作用有密切關係。因此，若能通過表達多個蛋白成分，並使之在特定環境中進行寡聚化裝配，獲得蛋白有效的空間構象，必然對提高免疫反應的敏感性，了解蛋白成分的相互作用極為有利。所以，近年來利用該系統表達寡聚蛋白質的研究尤其引人矚目。Roy等[14]在1996年採用桿狀病毒多啟動子表達載體成功的進行了藍舌病毒（BTV）外殼蛋白VP3、VP7、VP2、VP5的共表達，發現當VP3、VP7共表達時可形成BTV類核心顆粒，而同時表達4種成分時可形成不含病毒核酸的類病毒顆粒（VLP）。VLP的獲得對了解病毒蛋白在細胞中的裝配過程和研究各蛋白質間的相互作用奠定了基礎，更重要的是這類VLP與天然病毒粒子有極為相似的空間結構，這種特定的構象必然具有較好的抗原性和免疫原性。VLP的研究為發展有效的基因工程疫苗和敏感的診斷試劑提供了新的思路。桿狀病毒具有多種優點，是十分有發展前景的表達系統。目前，研究及套用最多的桿狀病毒系統為AcNPV，儘管它可感染30多種細胞，但主要在Sf細胞中繁殖，因此，對於其它細胞是否易感，以及外源蛋白表達水平、轉錄後加工等問題還需進行深入研究。如果在產物純化過程中有昆蟲細胞蛋白的摻入，則可能在套用時引起哺乳動物的過敏反應，因此，如何純化產物，使其導致的過敏反應降到最低限度是十分值得重視和探討的問題。
