基本介紹
- 中文名：循環DNA
- 外文名：Circulating free DNA
- 發現人： Mandel和Metais
- 發現日期：1947年
- 簡稱：循環核酸
簡介,提取方法,血漿游離核酸純化試劑盒,醫學套用,循環DNA與腫瘤的相關性,
簡介
循環核酸最早由 Mandel和Metais於1947年發現（Les acides nucl´eiques du plasma sanguin chez l’homme[J]. C R Hebd Seances Acad Sci (Paris), 1948, 142(3): 241-3），但由於缺乏高靈敏性和高特異性的實驗方法，導致有關血中cfDNA與疾病相關性的研究在較長時期內進展緩慢。直到有效分離cfDNA技術的出現，和特殊螢光染料與PCR技術相結合的檢測技術的套用，使這一領域的研究在最近二十多年得到了較迅速發展。自發現血中cfDNA可含腫瘤細胞DNA相同基因突變後，套用分子生物學手段對循環遊離核酸的研究的興趣日益增加。
提取方法
血漿游離核酸純化試劑盒
1.在兩個1.5ml離心管（用戶自備）中加入20µl蛋白酶K貯存液，再加入200µl同一個血漿樣本。
*不要將蛋白酶K直接加入到BufferVL中。
2．分別加入200µl含CarrierRNA的BufferVL，旋渦振盪約15秒混勻。
3.將離心管置於56°C水浴10分鐘。
4.分別加入320µl無水乙醇，溫和地翻轉4~6次混合均勻。
*為避免打開管蓋時樣品間的交叉污染，開蓋前可低速離心數秒，使管蓋上的溶液沉降到管底。
5.吸取步驟4中的一管混合液加入到核酸純化柱中（核酸純化柱置於2ml離心管中），蓋上管蓋，12000rpm離心30秒。
*注意不要將溶液沾到純化柱管口的邊緣上，以免後續的洗滌步驟不能洗淨純化柱。
6．棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2ml離心管中，將步驟4中的另一管混合液加入到同一個核酸純化柱中。
*濾液無須徹底棄盡，如果要避免粘附在離心管管口的濾液對離心機的污染，可將2ml離心管在紙巾上倒扣拍擊一次。
7．棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2ml離心管中，在核酸純化柱中加入500µlBufferWA,蓋上管蓋，12000rpm離心30秒。
*確認在BufferWA中已經加入無水乙醇。
8．棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2ml離心管中，在核酸純化柱中加入700µlBufferWB,蓋上管蓋，12000rpm離心30秒。
*濾液無需徹底棄盡，如果要避免粘附在離心管管口的濾液對離心機的污染，可將2ml離心管在紙巾上倒扣拍擊一次。
*確認在BufferWB中已經加入無水乙醇。
9．棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2ml離心管中，14000rpm離心1分鐘。
*如果離心機的離心速度達不到14000rpm，則用最高速離心2分鐘。
*請勿省略該步驟，否則可能因所純化的核酸中混有乙醇而影響後續的PCR效果。
10.棄2ml離心管，將核酸純化柱置於一個試劑盒提供的1.5ml離心管中，在純化柱的膜中央加入25-30µl56℃預熱的BufferTE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心30秒。
11.棄純化柱，洗脫的血漿游離核酸可立即用於PCR或RT-PCR檢測，或者將血漿游離核酸儲存於-20℃備用。
醫學套用
血中cfDNA在疾病的早期診斷、預後、監測等方面具有重要潛在價值。其具體醫學套用大致包括以下方面：
1. 用於產前診斷；
2. 用於免疫性疾病等非腫瘤類疾病的病情分析與療效觀察；
3. 用於腫瘤相關分析。
在上述三類套用中，其在腫瘤分析中的價值尤為重要，雖然目前血中cfDNA分析尚未列為臨床必需的檢測指標，但數以千計的研究論文和大量一期和二期臨床試驗的數據，有力支持這一新技術在腫瘤防治中的巨大套用價值：
腫瘤的早期診斷；
腫瘤治療方案確定；
腫瘤療效觀察；
腫瘤預後評估；
腫瘤轉移風險分析；
腫瘤復發監測。
循環DNA與腫瘤的相關性
無須有創腫瘤活檢，而是從常規抽血中分析來自腫瘤的DNA，這一能力代表了潛在轉化性臨床套用的一個關鍵進展（圖1）。特別是cfDNA分析屬於微創，為活檢困難或不安全的腫瘤提供了一種分子譜分析方法，並提供了一種能夠隨時間推移連續監測腫瘤DNA的實用方法，而沒有標準腫瘤活檢的風險和潛在併發症。此外，與單個腫瘤病變的針吸活檢相比，cfDNA分析可以更好地檢測患者腫瘤中多個不同克隆群所具有的分子異質性。最後，cfDNA分析為無臨床明顯疾病的患者提供了腫瘤檢測或監測的可能性。
（圖1）cfDNA分析的臨床套用
在癌症發展、診斷和治療的整個自然過程中，cfDNA分析在多處具有潛在的套用。目前正在開發用於篩查cfDNA中新生腫瘤證據的早期檢測方法。通過能夠在無症狀人群中識別早期癌症的液體活檢，可能在治癒可能性較大的階段識別癌症。實施根治目的的手術之後，可以分析在術後數周內採集的術後血漿中的cfDNA，確定已知存在於患者切除腫瘤中的突變或其他改變是否持續存在。由於cfDNA的半衰期非常短（1小時或更短），因此如果有證據表明術後血漿cfDNA中持續存在來自腫瘤的突變，則提供了直接證據證明患者存在可能最終導致腫瘤復發的殘留疾病。如果在術後不久檢出cfDNA中的殘留疾病，則可以根據復發風險對患者進行分層，並可能有機會通過早期干預採取挽救性治癒。在轉移性疾病的背景下，cfDNA的臨床測序可以識別可能採取靶向治療的遺傳改變，以選擇精準療法。cfDNA測序與腫瘤測序相比，可以識別出許多相同的靶變化，因此當腫瘤材料不足以用於臨床測序時，這可能特別有用。研究已經提示，ctDNA水平與整體腫瘤負荷密切平行，可用作監測治療應答和耐藥性發展的準確方法。疾病進展時，cfDNA分析已被證明可有效識別導致耐藥的新發基因改變，這可以指導隨後的治療選擇。由於在獲得性耐藥的背景下可能存在廣泛的腫瘤異質性，因此cfDNA分析可以識別不同腫瘤轉移中存在的多個並存的耐藥改變，而單個腫瘤活檢無法檢出這樣的改變。cfDNA分析已用於監測後續治療期間多個腫瘤亞克隆的克隆動態，該方法可為對治療產生的混合臨床應答提供分子基礎。
