DNA合成儀

設計用於合成結構上類似DNA或RNA的寡核苷酸的自動化儀器。一般套用於固相合成法，每次將一個核苷酸加到所接長的寡核苷酸鏈上，加入每一個核苷酸都利用相同的化學反應與相應的嘌呤或嘧啶鹼基衍生物作用。所用化學反應和操作細節隨不同的儀器而改變，最廣泛套用的方法是DNA合成的磷酸醯胺法。

基本介紹

• 中文名：DNA合成儀

結構和性能

試劑驅動系統

一般地，DNA 合成儀採用一定壓力的惰性氣體（氬氣）或氮氣及電磁閥組驅動液體試劑，也可採用氦氣驅動試劑。某些合成儀採用slider block滑塊系統及精密蠕動泵，可不採用氣體為驅動系統。採用氣體及電磁閥驅動液體試劑時，需首先將管路系統電磁閥前段，含試劑瓶組中壓力加壓到規定氣壓，通過合成管理軟體或手動打開電磁閥（一般打開時間為數ms），即可驅動液體試劑到所需的合成柱中。

試劑和鹼基瓶組

DNA合成儀一般需鹼基瓶組及試劑瓶組。試劑瓶組一般最少為6個，含脫保護劑（Deb）、活化劑（act）、蓋帽試劑A（capA)、蓋帽試劑B(capB)、氧化劑（OXI）及洗脫乙腈（ACN），每種儀器一般都多設定1-2個試劑瓶位，用於特殊產物的合成。鹼基瓶組一般最少為4個標準鹼基（A/C/G/T）,同時搭配2-多個特殊鹼基瓶位，用於螢光標記等合成。

壓力管路及輸送管路

DNA 合成儀的一般原則需要保持內外氣體隔絕，因此無論試劑瓶、鹼基瓶均需密封保持一定壓力。所有壓力管路目前均採用特氟龍導管，直徑為1/16—1/8吋。每個瓶子都有一個氬氣壓力管道及輸送管道進入瓶蓋插塞，對於亞磷醯胺，1—8號瓶其壓力管道也作為排氣管。氬氣管要保持在液體水平以上，而輸送管卻伸到瓶的底部。當閥門正確設定打開時，儲液瓶上部空間由氬氣加壓，液體被推進輸送管，流到其目的地。

亞磷醯胺瓶排氣

除了加壓外，亞磷醯胺瓶都是用壓力排氣管排氣的。把亞磷醯胺放入儀器前，要用氬氣排除空氣使其淨化。淨化是通過輸送管輸送氣體，當氣體輸送到瓶內時，空氣經壓力排氣管排出。這是由瓶子更換步驟自動完成的。廢液瓶是輸送系統的低壓側，必須將出口與大氣相通。要確保排氣管通到通風櫃。如果排氣管阻塞，將會產生反壓，試劑和溶劑的輸送會受到抑制。

輸送電磁閥

試劑輸送系統包括兩個試劑閥塊(8鹼基儀器有3個)及2個或4個柱閥塊。閥塊控制氣體和化學試劑流入柱子及出口。除亞磷醯胺和四唑以外，試劑和溶劑都被同時輸送到所有活化柱。當有多個活化柱時，對流速的細微變化，以自動調節每個柱子的輸送次數來補償。每一個5—連線埠柱閥塊將流出物導入廢液口、DMT收集口，或DNA收集瓶，它也控制用於除去或沖洗柱內和柱閥塊內的試劑的氬氣。

輔助真空

對於閥塊的適當運行，關鍵是隔膜形成一個圓頂小空隙，每次電磁閥打開時，抽氣泵為每個閥塊提供了輔助真空，輔助真空在隔膜的螺線管一側形成，使隔膜形成一圓頂空隙。

合成柱

起始結合在載體（一般為CPG）上的核苷酸是裝在一次性的柱子中，除柱體外，還有2個固定過濾板和2個接頭，所有的部件都由惰性材料製成。固定過濾板是多孑L性聚苯乙烯固定在兩端蓋子中。入口和出口都是母路厄氏(1uer)接頭，與儀器的公路厄氏接頭配對。柱子是對稱的(沒有頂端和底部、前後之分)，可以以任何方式與公路厄氏接頭相連線。每一個柱子都用顏色編號，表示不同的起始核苷酸，以及有一個唯一的連續順序號碼。正常的流路是從底部進入，通過向上輸送液體，使CPG顆粒上升並保持懸浮狀態。溶劑和試劑的流速已經設定好，能使顆粒適當地混合。

路節流閥

試劑通過底部的luer接頭，流到柱子，如果沒擰上下面的一個luer接頭，應會在一個圓柱形的玻璃流路節流閥上發現。試劑通過流路節流閥中一個很小的通道流到柱子。小量的試劑可以在流路節流閥中結晶，長期這樣會造成流路阻塞。

廢液和排氣

大多數化學試劑輸送的最終點是廢液瓶，廢液瓶是一個空立著的10L的聚苯乙烯容器，可放在合成儀附近的地板上或放在低於儀器的附近工作檯上。排氣管將廢氣導入適當的排氣裝置，如排煙罩

電導池

電導流動池是為了測定在每個DNA合成循環內釋放的DMT陽離子的總電導而設計的。流動池是由一空隙隔開的兩個電極組成，在空隙之間套用一小電壓。DMT陽離子流過電導池時起電導作用。

電池

DNA合成儀一般帶有鋰電池，可以使用幾年。當主電源斷開時，所有的合成參數都被保留下來。這些參數包括儲存的DNA序列，用戶設定的循環、步驟和功能，以及瓶子使用資料等。如果正在合成中電源出現故障，合成將被中斷，只有主電源恢復時合成才可重新開始。電池還保持合成儀內部的時鐘計時。

控制器

控制器指導和初始合成儀的所有活動，它的主要部分是軟體、微處理機、顯示螢幕、鍵板及相關的電子部件。軟體控制合成的所有必要操作並由微處理機來解釋和執行。軟體儲存在一個可取出的存儲卡中，這個存儲卡插在儀器的背面。合成信息顯示在液晶顯示屏上，通過選擇鍵板上的鍵可與儀器交流。軟體是“選單驅動”，通過按適當的鍵，可選擇一項，給予指令。為了完成自動合成，軟體套用一個包含一系列步驟的循環來完成全部化學反應。

操作步驟

以亞磷醯胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷醯胺DNA合成的試劑有：保護鹼基的5/—DMT，A、G、C、T亞磷醯胺單體，四唑偶聯催化劑，乙酐，N—甲基咪唑封閉試劑，三氯乙酸(TCA)脫保護溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶劑，氨水切除溶液。使用步驟如下：

1)仔細檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量，必要時換掉試劑瓶，特別注意乙腈的量，因為該溶劑用量較大。

2)將標記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。

3)將要合成的DNA序列輸入合成儀。

4)檢查選擇的合成步驟是否正確。

5)選擇結束方法：TritylOffAuto是儀器的原始狀態，若打算以5，—DMT基團連線純化寡核苷酸，將其轉變為TritylOnAuto結束狀態。

6)選擇結束方法，一般為系統的原始狀態。

7)在每個柱監視器的Username下，輸入你所希望的保存名字。

8)以代碼代替相應的DNA序列標記每一個收集瓶。

9)列印出每一個柱設定的詳細資訊。

10)檢查列印出來的資料是否正確。

11)運行StartColumn步驟檢查每一個柱的位置，確保合成儀上合成柱處於正確的位置。

12)檢查連線在合成儀上的溶劑殘留(廢液瓶)是否充滿。

13)如果分部收集器用來收集每個DMT脫保護步驟的流出物，確保試管充分清潔乾淨，並打開分部收集器，確保DMT廢液管路通向分部收集器。

14)啟動循環，運行開始程式清洗試劑管路，除去原來的試劑。

注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，並將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中。

日常維護

1．瓶塞“O”形環

一月檢查一次“O”形環，最少1年更換1次。將新的備用“O”形環與儀器上的相比較，如果在“O”形環上出現白色沉澱，用棉花蘸取乙腈，進行清洗。更換“O”形環的步驟如下：用止血鉗夾住“O”形環，從槽中取下(或用牙籤鉤下)，注意不要損壞托住“O”形環的白色聚氟乙烯插塞(tefloninsert)；確保插塞上沒有顆粒後，用手指將新“O”形環推進槽，進行壓力實驗。

2．儲液瓶

瓶子都要放在亞磷醯胺及儲液瓶位置上，並保持氬氣壓力以及管路清潔。

3．流路節流閥

為了防止阻塞，節流閥應該1個月清洗1次，清洗時，先在水中煮沸15min，然後再在甲醇中超音波清洗。

特點與性能

一、按照不同用途，DNA合成儀可分為實驗室型，工業型和大規模合成三種主要類型。

1，實驗室型：主要指合成通量較小，且單柱合成產物為10-1000nmol的DNA合成儀，一般為合成柱數低於48柱（含）的DNA合成儀，主要適用於化學生物學實驗室，或某些剛起步的商業機構。

該類型DNA合成儀品牌較多，包括已停產的ABI391,394,3400,3900，BECKMAN oligo-1000，及仍然量產的polygen 10柱，12柱，mermade4，6,8,12,48柱；BIOSSET ASM-800， AZCO OLIGO-8等。

2， 工業型

工業型合成儀,主要指合成通量大，且單柱合成產物為10-1000nmol的DNA合成儀。工業型合成儀常見的合成柱數為96柱、192柱，384柱或更多合成柱數的合成儀較為鮮見。主要適用於大型實驗室，公用實驗平台及商業合成機構。國內主要的商業合成機構如上海生工，北京賽百盛，上海捷瑞，華大基因，金斯特，金維斯等。

該類型DNA合成儀較實驗室型品牌相對較少，常見的品牌有美國biolytic，丹麥oligomaker，美國mermade，美國polyplex等。在歐洲，polygen 96柱合成工作站及384柱合成塔也是較常見的工業型合成儀之一。

3，大規模合成型

大規模合成型主要指單柱合成產物量可達數克，甚至數公斤的合成儀，主要用於原料藥製備等科研或商業用途。目前，能夠提供大規模合成儀的廠家主要為GE health及國產的pilot 500。

二、按試劑鹼基添加方式分類，DNA合成儀可分為電磁閥氣動驅動，蠕動泵驅動兩種類型。

1，電磁閥氣動驅動型：採用高於大氣壓的惰性氣體（氬氣，氮氣或氦氣）為鹼基試劑溶液的驅動方式，通過微量電磁閥的開合添加試劑或鹼基溶液。主要品牌包括ABI系列合成儀，oligomaker系列合成儀，biolytic系列合成儀，GE系列合成儀及mermade系列DNA合成儀等。

2，採用蠕動泵驅動型：採用精密蠕動泵為鹼基試劑溶液的驅動方式，通過蠕動泵驅動，滑塊的相互滑動選擇添加不同鹼基試劑溶液。主要品牌包括德國POLYGEN 系列DNA合成儀。

三、按產物承載容器分，可分為需要一次性合成柱，無需一次性合成儀兩類。除德國polygen系列合成儀外，其它所有品牌合成儀，如，oligomaker，mermade， ASM, POLYPLEX, ABI等都使用一次性合成柱作為合成產物的承載容器。

發展

當前DNA合成儀的主要生產廠商都致力於機器性能的完善和套用領域的開拓以及高效率、高產率的儀器的開發與研究。

台灣科學委員會“基因醫藥衛生科技尖端研究計畫”中的基因生物技術組已經成功研發全世界第一台高密度複製DNA合成儀，可以同時合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，並可以配合聚合酶連鎖反應裝置，大量複製各種基因，不但節省時間，也可節省大量人力，這部機器能複製動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。

由於人們所需要的大部分核酸的鹼基對數量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的最長核酸鏈的鹼基對數量，因此還需要不斷改善合成工藝才能得到較長的核酸分子。

為了能夠在將來改變酶的結構，使其在工業上更有價值；改變蛋白質和多肽的結構，製備新藥物；並開拓有關人類疾病和遺傳調控的新領域，化學合成DNA在這一過程中將起關鍵性作用。根據不同化學方法研製的DNA合成儀也將不斷湧現，能夠突破現有核酸合成的鹼基對數量限制，大量節省人力、物力、財力。