基本介紹
概念,分類,套用,其它信息,當前發展情況,其它套用,
概念
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由於RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高。早期採用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉錄或病毒複製過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。
分類
幾種常見RNA探針及其特點：
RNA探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：即特異性cDNA、cRNA探針和人工合成寡核苷酸探針。
- cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了套用雙鏈cDNA探針做雜交反應時存在的兩條之間的復性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應後可用RNA酶處理，以除去未結合的探針。由於cRNA探針具有以上這些優點，cRNA探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA探針高出8倍，因此在原位雜交中套用廣泛。cRNA探針的缺點是：探針的製備過程比較複雜，需要較好的分子生物學實驗設備，它對RNA酶敏感，易受破壞，操作中要謹防RNA酶污染。
- 單鏈cDNA探針：由於cDNA中不存在內含子及其它高度重複序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性。但由於單鏈cDNA探針的製備比較困難，在RNA原位雜交中已很少見有套用。
- 寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細胞中存在的高度重複序列帶來的不利影響。由於大多數寡核苷酸序列較短，不需要純化，組織穿透性極好。根椐目的基因的特異性序列設計的探針，特異性較強。合成的寡核苷酸探針的缺點是：探針長度必須適宜，探針太長可造成內部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結合。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。
套用
這類RNA探針主要用於研究目的，而不是用於檢測。例如，在篩選逆轉錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進行中的轉錄分析（nuclear run on transcrip－tion assay）時，在體外將細胞核分離出來，然後在α-32P-ATP的存在下進行轉錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標記，此混合mRNA與固定於硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進行雜交，便可反映出該基因的轉錄狀態，這是一種反向探針實驗技術。
其它信息
當前發展情況
近幾年體外轉錄技術不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉錄系統。該系統主要基於一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。這種體外轉錄反應效率很高，在1h內可合成近10μg的RNA產生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標記。該方法能有效地控制探針的長度並可提高標記物的利用率。
其它套用
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列）和反義RNA探針（與mRNA互補），反義RNA又稱cRNA，除可用於反義核酸研究外，還可用於檢測mRNA的表達水平。在這種情況下，因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高几個數量級。RNA探針除可用於檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達時，常常需要觀察該基因的轉錄狀況。在原核表達系統中外源基因不僅進行正向轉錄，有時還存在反向轉錄（即生成反義RNA），這種現象往往是外源基因表達不高的重要原因。另外，在真核系統，某些基因也存在反向轉錄，產生反義RNA，參與自身表達的調控。在這些情況下，要準確測定正向和反向轉錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
