基本介紹
- 中文名：哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗
- 外文名：Mammalian bone marrow cell chromosome aberration test
- 標準號：GB 15193.6-2003
- 標準狀態：現行
基本信息,主要內容,
基本信息
發布日期 IssuanceDate： 2003-9-24
實施日期 ExecuteDate： 2004-5-1
首次發布日期 FirstIssuance Date： 1994-8-10
複審確認日期 ReviewAffirmance Date： 2004-10-14
計畫編號 Plan No：
代替國標號 ReplacedStandard： GB 15193.6-1994
被代替國標號 ReplacedStandard:
廢止時間 RevocatoryDate：
採用國際標準號 AdoptedInternational Standard No：
采標名稱 AdoptedInternational Standard Name：
採用程度 ApplicationDegree：
採用國際標準 AdoptedInternational Standard：
國際標準分類號(ICS)： 07.100.30
中國標準分類號(CCS)： C53
標準類別 StandardSort： 方法
標準頁碼 Number ofPages: 8
標準價格(元) Price(￥)： 8
主管部門 Governor： 衛生部
歸口單位 TechnicalCommittees： 衛生部
起草單位 DraftingCommittee： 中國疾病預防控制中心營養與食品安全所
主要內容
哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗
InVivoMammalianBoneMarrowCellChromosomeAberrationTest
1範圍
規範規定了哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。
規範適用於檢測化妝品原料及其產品的遺傳毒性。
2規範性引用檔案
OECDGuidelinesforTestingofChemicals（No.475,April1997）
3試驗目的
試驗是一項致突變性試驗，檢測整體動物骨髓細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。
4定義
染色體型畸變(Chromosome-typeaberration)：染色體結構損傷，表現為在兩個染色單體的相同位點均出現斷裂或斷裂重組的改變。
染色單體型畸變(Chromatid-typeaberration)：染色體結構損傷，表現為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。
染色體數目改變(Numerical-fypeaberration)：哺乳動物細胞正常染色體數目的改變。
5試驗基本原則
使哺乳動物（如大鼠或小鼠）經口或其它適宜途徑染毒，動物處死前用細胞分裂中期阻斷劑處理，處死後製備骨髓細胞染色體標本，分析染色體畸變。
6試驗方法
6.1實驗動物和飼養環境：選用健康成年大鼠或小鼠，每組每種性別至少5隻。
實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。
6.2受試物
6.2.1受試物配製：固體受試物應溶解或懸浮於適合的溶劑中，並稀釋至一定濃度。液體受試物可直接使用或予以稀釋。受試物應在使用前新鮮配製，否則就必須證實貯存不影響其穩定性。
6.2.2溶劑的選擇：溶劑在所選用濃度下，不引起毒性效應，不與受試物發生化學反應。首選為水溶性溶劑。
6.2.3劑量設定：應進行預試驗以選擇最高劑量。當有毒性時，可以引起死亡或者抑制骨髓細胞有絲分裂指數（50%以上）為指標確定最高劑量。在第一次採集樣品時，需設定3個可供分析的劑量，在第二次採集樣品時，則僅需設定最高劑量組。
如果一次劑量為2000mg/kg體重時仍未引起毒性效應，則只設2000mg/kg體重劑量組。
6.3對照：在每項試驗中，對每種性別均應設陰性對照組和陽性對照組。除不使用受試物外，其它處理與受試物組一致。
6.3.1陰性對照：除設溶劑對照（即僅含溶劑）外，如果沒有文獻資料或歷史性資料證實所用溶劑不具有有害作用或致突變作用，還應設空白對照組。
6.3.2陽性對照：陽性對照物應能引起染色體結構畸變率明顯高於背景資料。染毒途徑可以不同於受試物。所選用的陽性對照物最好與受試物類別有關。可以使用下述物質：三亞乙基密胺（triethylenemelamine）、甲磺酸乙酯（ethylmethanesulphonate）、乙基亞硝基脲（ethylnitrosonrea）、絲裂黴素C（mytomycinC）和環磷醯胺（cyclophosphamide）。
6.4染毒方式：可採用經口或其它適宜的染毒方式。一般情況下，染毒1次，但分兩次採集樣品,即每組動物分兩個亞組，亞組1於染毒後12h~18h處死並採集第一次樣品；亞組2於亞組1處死後24h採集第二次樣品。如果採用多次染毒，於末次染毒後12h~18h採集樣品。於處死動物採集樣品前腹腔注射細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，於處死前4h，按4mg/kg體重給藥）。
6.5試驗步驟
6.5.1用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剔除肌肉等組織。
6.5.2剪去股骨兩端，用注射器吸取5mL生理鹽水，從股骨一端注入，用10mL離心管，從股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。
6.5.3將細胞懸液以1000r/min的速度離心5min~7min，去除上清液。
6.5.4加入0.075mol/LKCl溶液7ml，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7min，加入2mL固定液（冰醋酸:甲醇=1:3），混勻，以1000r/min速度離心5min~7min，棄去上清液。
6.5.5加入7mL固定液，混勻，固定7min，以1000r/min的速度離心7min，棄去上清液。
6.5.6用同法再固定1~2次，棄去上清液。
6.5.7加入數滴新鮮固定液，混勻。
6.5.8用混懸液滴片，自然乾燥。
6.5.9用姬姆薩染液染色。
6.6讀片和結果處理
6.6.1確定有絲分裂指數：包括所有處理組、陽性和陰性對照組（每隻動物計數1000個細胞）。
6.6.2計數畸變細胞：對每隻動物選擇100個分散良好的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應記錄每一觀察細胞的染色體數目，對於畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。所得各組的染色體畸變率用X2檢驗進行統計學處理，以評價試驗組和對照組之間是否有顯著差異。
6.7結果評價
當受試物引起染色體畸變數具有統計學意義，並有與劑量相關的增加或者在一個劑量組出現染色體畸變細胞數明顯增高，則判定具有致突變性。當結果不能得出，應改變試驗條件進一步進行測試。
在評價時應綜合考慮生物學意義和統計學意義。
7試驗報告
報告應包括下列項
(1)受試物名稱、理化性質、所用溶劑及配製；
(2)動物種屬和品系、體重、數量、性別、來源（註明合格證號和動物級別）；
(3)實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；
(4)劑量和組別：選擇劑量的原則、劑量和組別、陰性和陽性對照物及劑量；
(5)試驗條件和方法：染毒途徑和染毒方案、細胞毒性測定方法、所用的細胞分裂中期阻斷劑及其劑量和採樣時間、簡述製備染色體的方法；
(6)觀察和分析的細胞數；
(7)畸變類型和數量及畸變率；
(8)結論。
8結果解釋
陽性結果證明受試物具有引起該種受試動物骨髓細胞染色體畸變的能力。
陰性結果表明在本試驗條件下受試物不引起該種受試動物骨髓細胞染色體畸變。
InVivoMammalianBoneMarrowCellChromosomeAberrationTest
1範圍
規範規定了哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。
規範適用於檢測化妝品原料及其產品的遺傳毒性。
2規範性引用檔案
OECDGuidelinesforTestingofChemicals（No.475,April1997）
3試驗目的
試驗是一項致突變性試驗，檢測整體動物骨髓細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。
4定義
染色體型畸變(Chromosome-typeaberration)：染色體結構損傷，表現為在兩個染色單體的相同位點均出現斷裂或斷裂重組的改變。
染色單體型畸變(Chromatid-typeaberration)：染色體結構損傷，表現為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。
染色體數目改變(Numerical-fypeaberration)：哺乳動物細胞正常染色體數目的改變。
5試驗基本原則
使哺乳動物（如大鼠或小鼠）經口或其它適宜途徑染毒，動物處死前用細胞分裂中期阻斷劑處理，處死後製備骨髓細胞染色體標本，分析染色體畸變。
6試驗方法
6.1實驗動物和飼養環境：選用健康成年大鼠或小鼠，每組每種性別至少5隻。
實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。
6.2受試物
6.2.1受試物配製：固體受試物應溶解或懸浮於適合的溶劑中，並稀釋至一定濃度。液體受試物可直接使用或予以稀釋。受試物應在使用前新鮮配製，否則就必須證實貯存不影響其穩定性。
6.2.2溶劑的選擇：溶劑在所選用濃度下，不引起毒性效應，不與受試物發生化學反應。首選為水溶性溶劑。
6.2.3劑量設定：應進行預試驗以選擇最高劑量。當有毒性時，可以引起死亡或者抑制骨髓細胞有絲分裂指數（50%以上）為指標確定最高劑量。在第一次採集樣品時，需設定3個可供分析的劑量，在第二次採集樣品時，則僅需設定最高劑量組。
如果一次劑量為2000mg/kg體重時仍未引起毒性效應，則只設2000mg/kg體重劑量組。
6.3對照：在每項試驗中，對每種性別均應設陰性對照組和陽性對照組。除不使用受試物外，其它處理與受試物組一致。
6.3.1陰性對照：除設溶劑對照（即僅含溶劑）外，如果沒有文獻資料或歷史性資料證實所用溶劑不具有有害作用或致突變作用，還應設空白對照組。
6.3.2陽性對照：陽性對照物應能引起染色體結構畸變率明顯高於背景資料。染毒途徑可以不同於受試物。所選用的陽性對照物最好與受試物類別有關。可以使用下述物質：三亞乙基密胺（triethylenemelamine）、甲磺酸乙酯（ethylmethanesulphonate）、乙基亞硝基脲（ethylnitrosonrea）、絲裂黴素C（mytomycinC）和環磷醯胺（cyclophosphamide）。
6.4染毒方式：可採用經口或其它適宜的染毒方式。一般情況下，染毒1次，但分兩次採集樣品,即每組動物分兩個亞組，亞組1於染毒後12h~18h處死並採集第一次樣品；亞組2於亞組1處死後24h採集第二次樣品。如果採用多次染毒，於末次染毒後12h~18h採集樣品。於處死動物採集樣品前腹腔注射細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，於處死前4h，按4mg/kg體重給藥）。
6.5試驗步驟
6.5.1用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剔除肌肉等組織。
6.5.2剪去股骨兩端，用注射器吸取5mL生理鹽水，從股骨一端注入，用10mL離心管，從股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。
6.5.3將細胞懸液以1000r/min的速度離心5min~7min，去除上清液。
6.5.4加入0.075mol/LKCl溶液7ml，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7min，加入2mL固定液（冰醋酸:甲醇=1:3），混勻，以1000r/min速度離心5min~7min，棄去上清液。
6.5.5加入7mL固定液，混勻，固定7min，以1000r/min的速度離心7min，棄去上清液。
6.5.6用同法再固定1~2次，棄去上清液。
6.5.7加入數滴新鮮固定液，混勻。
6.5.8用混懸液滴片，自然乾燥。
6.5.9用姬姆薩染液染色。
6.6讀片和結果處理
6.6.1確定有絲分裂指數：包括所有處理組、陽性和陰性對照組（每隻動物計數1000個細胞）。
6.6.2計數畸變細胞：對每隻動物選擇100個分散良好的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應記錄每一觀察細胞的染色體數目，對於畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。所得各組的染色體畸變率用X2檢驗進行統計學處理，以評價試驗組和對照組之間是否有顯著差異。
6.7結果評價
當受試物引起染色體畸變數具有統計學意義，並有與劑量相關的增加或者在一個劑量組出現染色體畸變細胞數明顯增高，則判定具有致突變性。當結果不能得出，應改變試驗條件進一步進行測試。
在評價時應綜合考慮生物學意義和統計學意義。
7試驗報告
報告應包括下列項
(1)受試物名稱、理化性質、所用溶劑及配製；
(2)動物種屬和品系、體重、數量、性別、來源（註明合格證號和動物級別）；
(3)實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；
(4)劑量和組別：選擇劑量的原則、劑量和組別、陰性和陽性對照物及劑量；
(5)試驗條件和方法：染毒途徑和染毒方案、細胞毒性測定方法、所用的細胞分裂中期阻斷劑及其劑量和採樣時間、簡述製備染色體的方法；
(6)觀察和分析的細胞數；
(7)畸變類型和數量及畸變率；
(8)結論。
8結果解釋
陽性結果證明受試物具有引起該種受試動物骨髓細胞染色體畸變的能力。
陰性結果表明在本試驗條件下受試物不引起該種受試動物骨髓細胞染色體畸變。
