免疫細胞化學技術

免疫細胞化學，又稱免疫組織化學，其主要原理是用標記的抗體或抗原對細胞相應抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測，經過化學的呈色反應後，用顯微鏡或電子顯微鏡觀察。

該技術是免疫螢光技術與形態學技術結合的產物。

基本介紹

• 中文名：免疫細胞化學技術
• 外文名：Immunohistochemistry
• 學科：組織化學
• 特點：具有特異性高和親和力強的抗體

概述

免疫組化，是套用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（螢光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

抗原和抗體的要求

· 具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。

– 對抗體的要求：純度高、比活性強；

· 高度特異性抗體的獲得，取決於抗原的純度。

– 對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩定無變化。

抗原 (antigen, Ag)

· 抗原的概念：凡是在機體內引起體液免疫和(或)細胞免疫反應的物質，稱為抗原。抗原具有兩個方面的特性：

– 免疫原性：引起機體產生抗體和(或)致敏淋細胞的特性；

– 免疫反應性：抗原能與相應的抗體及致敏淋巴細胞發生特異的結合或反應的特性。

· 根據抗原是否顯示免疫原性分為：

– 完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，並具有較複雜的化學組成。

· 免疫原性最強的是蛋白質抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質及多糖形成複合物才具有良好的免疫原性。

– 半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。

· 半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。

載 體

· 通常是具有高度免疫原性的大分子物質，具有將免疫原性傳遞給耦聯的半抗原能力。

– 常用的載體有鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。

– 用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結合到載體上。結合比例為5kDa結合5～25個分子的小肽。

抗體 (antibody, Ab)

1、抗體的概念：

免疫球蛋白

· 機體受到抗原刺激後，由漿細胞合成並分泌出一類具有與抗原發生特異性結合的球蛋白，被稱為抗體。

– 抗體主要存在於血清內；

– 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白並不一定都是抗體。

– 免疫球蛋白根據重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。

· 單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是套用細胞融合雜交瘤技術免疫動物製備的。

– 特異性強、抗體產量高。

· 多克隆抗體：是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

– 特異性低，會產生抗體的交叉反應。

– 多克隆抗體廣泛套用於石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。

– 抗原與抗體的結合，要求量保持一定比例，當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。

3、抗體的製備——多克隆抗體的製備

· 動物的選擇

· 佐劑(adjuvant)

· 免疫方法

· 免疫劑量

· 抗體效價的測定

· 放血或定期抽血

(1) 動物的選擇

選擇什麼動物來免疫取決於：

· 所需抗血清的量

– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。

· 能供免疫用的抗原量

– 小鼠50μg足夠，而山羊需要幾毫克。

(1) 動物的選擇(續)

· 動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。

– 例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來製備抗體。

– 常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔(紐西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性)為最常用。

(2) 佐劑 (adjuvant)

· 一般可溶性抗原注射後，迅速從注射部位擴散、吸收代謝。佐劑可延長滯留時間，且延長免疫刺激作用。因此在製備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。

· 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為：

– 弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)

– 弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)

弗氏不完全佐劑

(Freund's incomplete adjuvant, FIA)

· 是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可根據需要而定，通常2:1。

· 使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。

弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant, FCA)

· 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結核分枝桿菌(終濃度為2～20mg/ml)，即成為FCA。

· 免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化後(油包水)注入動物。

– 一般首次注射時用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。

佐劑與抗原乳化的方法

· 研磨法：適於製備大量的佐劑抗原

– 先將不完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。

– 按同樣方法滴人抗原，每加一滴應研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人後，應成為乳白色粘稠的油包水乳劑。

· 缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜採用。

佐劑與抗原乳化的方法(續)

· 注射器混合法

– 將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內，然後插入三通管內，交替推動針管混勻，往復操作直至形成粘稠的乳劑為止。

· 優點：無菌操作，節省抗原或佐劑。

· 缺點：不易乳化，時間長。

佐劑與抗原乳化的方法(續)

· 快速乳化法：利用超音波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。

– 將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置於超音波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎離心管。

– 每次乳化 10～15s，然後置冰櫃lmin左右。反覆乳化3～4次即可完全乳化。管內殘餘量800r/min離心5～10min收集。

· 優點：簡單、快速、節省材料。

乳化劑的鑑定

· 判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上(冷水中)，如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達到要求。

(3) 免疫方法——免疫途徑

· 常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內、淋巴結、腳掌等注射。

· 一般採用多點注射方法

– 常在足、掌、腋窩淋巴結周圍、背部兩側、頜下、耳後等處的皮內或皮下。

– 皮內易引起細胞免疫反應，有利於提高抗體的效價。

(3) 免疫方法——免疫途徑 (續)

· 幾點說明：

– 大動物一般不用腹腔注射

– 顆粒抗原和使用佐劑時不能靜脈注射

– 抗原寶貴可採用淋巴結內微量注射法，只需10～100g抗原即可獲得較好的免疫效果。

– 皮內注射較困難，特別是天冷時更難注入。

(3) 免疫方法——次數及間隔時間

· 次數一般為2～3次(初次免疫和加強免疫)

– 首次注射後，10～15天再加強注射；

– 劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑。

· 間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長

– 豚鼠、大鼠為7～8天，兔子為10～15天，羊為14～28天；

– 第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。

舉例1：家兔的免疫

· 初次免疫

– 用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8點，每點0.1～0.2ml，也可肌肉內或皮內注射；

· 兩周后，加強免疫

– 將50～200g Ag於PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內注射；

· 抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈採血

– 抗體效價測定可用環狀沉澱試驗、瓊脂雙向擴散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，後者在1:16以上，即可採血，取血清進一步提純。

舉例2：微量抗原淋巴結內注射免疫家兔

· 一般選擇2.5～3.0kg的紐西蘭種公兔

– 先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；

– 10天后，見胭窩淋巴結腫大，然後將抗原注射至腫大的淋巴結內，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；

– 以後每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為25～50g；

– 末次注射兩周后兔耳放血測價 (可達1:128)。

舉例3：豚鼠和大鼠的免疫

· 初次免疫

– 用10～100g Ag加入FCA，在背部皮內注射4～6點，每點 0.lml，也可肌肉內或皮下注射；

· 加強免疫

– 每隔 7～8天，將10～50g Ag於 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；

· 抗體效價的檢測

(4) 免疫劑量

· 抗原性強的抗原量應小，過大反會引起免疫抑制；

· 免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。

(4) 免疫劑量 (續)

· 各種動物首次免疫抗原劑量和加強免疫的劑量

(5) 抗體效價的檢測

多采免疫雙向擴散法

【基本原理】

· 指抗原和抗體在同一凝膠內都擴散，彼此相遇後形成特異性的沉澱線。

– 將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一定間距的小孔內，使兩者進行相互擴散，當抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉澱線。

· 優缺點：簡便，但敏感性較低，易出現假陰性結果。

免疫雙向擴散法的操作步驟

· 將玻璃板用水洗淨後用75%乙醇沖洗，晾乾後放在水平台上備用。

· 將l % agar 融化後，置56C水浴。

· 在玻璃板上鋪膠，約1.5mm 厚，凝固後打孔(直徑 3rnm)，孔間距10mm。

· 中心孔加5l 抗原樣品，周圍孔內每孔加5l 抗血清(抗體預先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。

· 凝膠板置濕盒內，室溫擴散24h。

· 觀察結果。

抗體效價檢測的其它方法

· 環狀沉澱試驗，需較多的抗血清，現已很少用；

· 對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴散法敏感，較簡便、實用；

· 酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)。

(6) 放血或定期抽血

常用以下3種方法

· 頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動物採血常用此法。

· 心臟採血法：常用於家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當易引起動物死亡。

· 靜脈採血：家兔可用耳緣靜脈採血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈採血，這种放血法可隔日1次，有時可採集多量血液。

(6) 放血或定期抽血 (續)

· 採血過程中，動作要輕柔，儘量避免溶血

· 血液凝固後，及時離心收集血清，否則細胞溶解釋放的雜蛋白(例如蛋白水解酶)將污染抗體並將抗體水解，降低效價；

· 加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護劑如BSA、甘油等。

標本的製備

· 標本製備恰當，是免疫組化成功的首要條件

· 免疫組化對組織和細胞標本的要求

– 保持所檢標本原有的結構、形態；

– 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。

· 免疫組化的組織和細胞標本，製作流程與常規處理方法基本相同，但對組織、細胞的處理又有其特殊要求及注意事項。

– 各種抗原由於其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用於本實驗的最佳方法。

免疫組化中常用的組織和細胞標本

· 組織標本

– 石蠟切片

– 冰凍切片

· 細胞標本

– 組織印片

– 細胞培養片(細胞爬片)

– 細胞塗片

石蠟切片

· 石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法

– 最大優點是組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；

– 石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。

· 石蠟切片製作過程對組織內抗原顯現有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數免疫組化中首選的組織標本製作方法。

1、取材的特殊要求及注意事項

· 標本新鮮：一般在2h以內進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散。

· 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區，以形成自身對照。

– 細胞壞死後，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應儘可能避開壞死區。

1、取材的特殊要求及注意事項(續)

· 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態改變並加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃；

– 鑷取組織動作要輕；

– 經窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結果時應有所考慮。

2、固定及常用的固定液

· 取材後的組織需立刻投於固定劑中

– 固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態；

– 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。

· 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬於醛類和醇類。其固定原理不同，各有優缺點。

– 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

– 醇類（常用乙醇）

– 其它 （丙酮）

(1) 醛類

· 甲醛(福馬林)套用最廣

– 原理：形成分子間的交聯，影響蛋白構型而使之固定。

– 優點：形態結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。

– 缺點：

· 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；

· 醛基與抗原蛋白的氨基交聯形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構象出現空間障礙；

· 分子間交聯形成的格線結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。

– 注意事項：

· 縮短固定時間，降低固定溫度(4C)，為此組織塊不宜過厚。

· 改用中性緩衝福馬林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液配製成10%甲醛固定液，減少固定液pH的變化。

· 固定後充分水洗以減少分子間交聯。

· 切片在作免疫組化染色前，先經預處理使抗原再現(抗原修復)。

· 戊二醛：

– 穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯合用作免疫電鏡固定液。

· 多聚甲醛(常用4%)：

– 可用於免疫電鏡；也可用於免疫螢光染色。

· 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。

(2) 醇類

· 最常用的醇類固定劑是乙醇。

– 其固定作用：使細胞內蛋白、糖類發生沉澱。

– 優點：穿透性強、抗原性保存好。

– 缺點：

· 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。

· 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定後可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。

(3) 其它固定劑

· 丙酮：

– 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用於組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。

3、抗原修復——原因

· 常規的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：

– 抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；

– 蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。

· 要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。

3、抗原修復——方法

· 化學方法

· 加熱方法

– 水浴加熱法

– 微波照射法

– 高壓加熱法

– 酸水解法

(1) 化學方法

· 主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

– 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37C，10～40min，主要用於細胞內抗原的顯示；

– 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%～0.4%，消化時間為37C、30～180min，主要用於細胞間質抗原的顯示。

· 例如：Laminin、CollagenIV

(2) 水浴加熱法

· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續10～15分鐘。

– 優點：操作簡單、經濟，適用於所有的實驗室，

– 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。

(3) 微波照射法

· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續l0～15分鐘，冷卻後，按免疫組化染色步驟進行。

· 此方法由於微波場內極性分子、離子高速運動，撞擊交聯的網鏈，使抗原異常的構想恢復正常，且因分子運動產熱、效率高、時間短，對抗原再現效果好。

(4) 高壓加熱法暴露抗原

· 將玻片浸入抗原修復液內，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果。

· 由於高壓下受熱均勻，特別使用於大批量標本的染色。

(1) 酸水解法

· 酸水解可使交聯斷裂、暴露抗原。

· 將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。

· 此法能增強特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態結構。

加熱法的注意事項

· 達到規定的溫度(92～95C以上)；

· 維持一定的時間；

· 避免切片乾涸 (抗原可能完全丟失)；

· 加熱後必須經過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未摺疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；

· 修復液：

– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩衝液；

– 最新研究表明鹼性修復液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩衝液(pH8.0)。

4、載玻片的處理

· 抗原修復過程中，由於高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。

– 新載玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自來水沖洗後再用蒸餾水清洗；用綢布擦乾或烤箱烤乾。清潔的載玻片再用粘附劑處理。

· 常用的粘附劑有：

– APES（3-氨丙基三乙氧基矽烷）

– Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）

– 鉻明膠溶液

APES(3-aminopropyltriethoxysilane)

3-氨丙基三乙氧基矽烷

· 現用現配。用純丙酮或甲醇配製2%APES(v/v);

· 將洗淨的玻片浸於此液中20～30秒鐘；

· 取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結合的APES，置通風櫥中晾乾或60C烤箱烤乾。

Polv-L-Lysine (多聚賴氨酸)

· 將清潔玻片浸於100g/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37C放置30min，然後60C烤箱烘烤1h或室溫過夜乾燥。裝盒備用。

鉻明膠溶液

· 試劑：鉻明礬(chrome alum) 0.25g

明膠(gelatine) 2.5g

蒸餾水 500ml

· 先將鉻明礬溶解於40C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻後，即可使用。如有殘渣，可過濾後再用。

· 用時稍加溶化，切片浸入2～3min，過夜晾乾。

冰凍切片

· 冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接切片。

· 在切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程。

– 縮短了製片時間

– 抗原性不受損失

· 對穩定性差的抗原，如淋巴細胞表面抗原尤其適合。

· 組織凍結過程中，細胞內、外的水分會形成冰晶，凍結的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴重影響組織、細胞的形態結構。因此製備凍塊時要求低溫、速凍。

1、冰凍組織塊的常用方法

· 液氮中冰凍：組織投入液氮中 (一196C)中10～20sec；

· 乾冰中加入丙酮(或異戊烷)，液體立即氣化起泡，溫度降至一70C ，將組織投入，若在乾冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內結凍則更好；

– 上述組織在速凍時應浸埋於OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內，以保護組織。

– 製成凍塊後若需保存，應以鋁箔或塑膠薄膜封包，貯存於-70 C冰櫃。

2、切片

· 供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，並有連續性。

· 載玻片也應清潔無油污，但一般無需塗抹粘附劑；

· 切片時，使用恆溫冷凍切片機，在箱內溫度-25 C 。切片厚度一般為4～8m。

3、切片後處理

· 切好的冰凍切片，室溫下自然晾乾1～2h後，入4C丙酮固定10min，待乾燥後作免疫組化染色或封存於-20℃。

· 冰凍切片由於切片技術要求較高，不易得到連續性很好的切片，其形態結構亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便於長期貯存，因此冰凍切片的套用受限。

組織印片

· 將潔淨載玻片輕壓於已暴露病灶的新鮮組織切面，細胞即粘附於玻片，晾乾後浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然乾燥後染片或-20℃保存。

細胞培養片(細胞爬片)

· 貼壁細胞培養時，置蓋片於培養瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度後取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再進行免疫染色。

– 蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。

– 為了防止細胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。

細胞塗片

· 大多數細胞塗片由細胞懸液製成，包括：

– 血液、尿液、腦脊液；

– 體腔積液；

– 組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結或其他實質性組織

– 懸浮培養的細胞或貼壁細胞經消化後形成的懸液。

細胞塗片 (續)

· 細胞塗片的方法：

– 手塗法

· 將細胞濃度調節到106/ml左右，可直接塗於載玻片上，但要均勻、不重疊。

· 圖片範圍應小於1cm直徑，以節約試劑。

– 塗片機塗片法

· 將細胞樣品製成2×105～6/ml 細胞懸液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入塗片機內，1000rpm離心2min後細胞就均勻分布於玻片上。

常用染色方法

根據標記物的不同分為免疫螢光法、免疫酶標法、親和組織化學法。

免疫螢光法

【原理】

· 用於免疫螢光的標記物是小分子的螢光素，可標記抗體或抗原；

免疫螢光技術

· 螢光素經某種特定波長的光照射激發後，能發射出一種比激發光波波長更長而且能量較低的螢光，籍此可作定位觀察或示蹤；

· 藉助於螢光顯微鏡進行觀察。

1、常用的螢光素

· (1) 異硫氰酸螢光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)

· (2) 四甲基異硫氰酸羅丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)

· (3) 四乙基羅丹明 (RB200)

· (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)

(1) 異硫氰酸螢光素(FITC)

· 易溶於水和乙醇。

· 最大吸收光譜為490～495nm，最大發射光譜為 520～530nm．呈翠綠色螢光，分子量 389.4。

· 在鹼性條件下，FITC的異硫氰酸基在水溶液中與Ig的自由氨基形成共價鍵，成為標記的螢光抗體。一個lgG分子上最多能標記15～20個FITC分子。

(2) 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)

· 最大吸收光譜550nm，最大發射光譜620nm，呈紅色螢光，分子量為444。

· 與蛋白質結合的方式同FITC。

(3) 四乙基羅丹明(RB200)

· 不溶於水，易溶於乙醇和丙酮。

· 最大吸收光譜為570nm，最大發射光譜為595～600nm，呈橙紅色螢光，分子量為580。

· RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉變成磺醯氯(SO2Cl)，在鹼性條件下，易與蛋白質的賴氨酸-氨基反應而標記在蛋白分子上。

(4) 碘化丙啶(PI)

· 是常用的DNA螢光標記探針，可作為FITC的胞核對比染色。

· PI可嵌入到雙鏈DNA和RNA鹼基對中並與之結合，但對鹼基無特異性選擇。

· 最大吸收光譜是493nm，最大發射光譜是630nm，呈紅色螢光。

2、螢光抗體的保存

· 一要防止抗體失活，二要保持螢光素不脫落和不受激發猝滅。

– 一般認為0～4C可保存1～2年，-20C可保存3～4年。

– 要小量分裝，防止反覆凍融。

– 保存前需加防腐劑 (濃度為1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000疊氮化鈉) 。

3、免疫螢光的染色方法

· 免疫螢光染色法常用的有

– 直接法

– 間接法

原理：將螢光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應 (用來檢測未知抗原)。

直接免疫螢光法的操作步驟

· 標本的處理：

– 細胞塗片、細胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然後用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；

– 石蠟切片經脫蠟、梯度酒精脫水後，進行抗原修復，然後用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；

· 2%BSA或10%BSA37C濕盒內封閉30min

· 抗體染色：

– 在標本片上滴加適當稀釋的螢光標記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37C孵育30min；

直接免疫螢光法的操作步驟(續)

· 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不時震盪(洗去多餘游離的螢光素標記的抗體)。

· 緩衝甘油封片

– 分析純無螢光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸鹽緩衝液1份配製。

· 鏡檢：在螢光顯微鏡下觀察。

· 優點：方法簡便、特異性高，非特異性螢光染色少。

· 缺點：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要製備一種螢光抗體。若檢測多種抗原需製備多種相應的螢光標記抗體。

直接免疫螢光法的注意事項

· 對螢光標記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；

· 一般稀釋度不應超過1:20，抗體濃度過低，會導致產生的螢光過弱，影響結果的觀察。

直接免疫螢光法的注意事項 (續)

· 染色溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化；

– 染色時間：從10 min到數小時，一般30 min；

– 染色溫度：多採用室溫(25C)，高於37C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可採用0-2C的低溫，延長染色時間。

– 低溫染色過夜較37 C 30 min效果好的多。

直接免疫螢光法的注意事項 (續)

· 試驗時需設定下列對照：

– 自發螢光對照(空白對照)：標本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。

– 陽性對照：用已知的陽性標本加螢光標記的特異性抗體。

– 特異性對照(抑制試驗)：標本加未標記的特異性抗體，再加螢光標記的特異性抗體。

· 若標本自發螢光對照和特異性對照呈無螢光或弱螢光，陽性對照和待檢標本呈強螢光，則為特異性陽性染色。

直接免疫螢光法的注意事項 (續)

· 一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有螢光減弱現象；

· 經螢光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，螢光強度會逐漸下降。

(2) 間接法又稱為螢光抗-抗體法

 需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(螢光素標記)。一抗對標本中的抗原來說起抗體的作用，但對螢光標記的二抗來說又起著抗原作用。

– 可用來檢測標本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。

間接免疫螢光法操作步驟

· 標本的處理及非特異染色的封閉同直接法；

· 一抗染色：

– 加未標記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37C作用30min或4C過夜。

· 0.01M PBST漂洗5min×3次(震盪漂洗)；

間接免疫螢光法操作步驟(續)

· 加螢光標記的二抗抗體，37C濕盒避光作用30min。

· 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；

· 甘油緩衝液封片

· 鏡檢

· 優點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；製備一種螢光標記抗體，可套用於多種一抗；

· 缺點：是參加反應的因子較多，產生非特異性染色的機會增多。

間接免疫螢光法的注意事項

· 螢光染色後一般在1h內完成觀察，或於4℃保存4h，時間過長 ，會使螢光減弱。

· 每次試驗時 ，需設定以下三種對照：

– 陽性對照：陽性血清+螢光標記物

– 陰性對照：陰性血清+螢光標記物

– 螢光標記物對照：PBS+螢光標記物

間接免疫螢光法的注意事項(續)

· 標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免乾燥。

· 一抗和二抗應始終保持在標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性螢光染色。

免疫酶酶標法

【原理】

· 以酶作為標記物與外加底物作用後產生不溶性色素，沉積於抗原和抗體反應的部位；

· 酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測定的抗原或抗體的量。

1、常用的標記酶及其顯色底物

· 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物

· 鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物

(1) 辣根過氧化物酶(HRP)及底物

· HRP是套用最廣的一種酶，來源於植物辣根，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結合而成，分子量約40kDa，穩定性好；

· 底物為過氧化物和供氫體(DH2)

– 過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。

– 供氫體：多用無色的還原型染料，通過反應生成有色的氧化 型染料，最常用的供氫體是DAB。

DAB (二氨基聯苯胺)

· DAB本身無色，反應後呈棕色，不溶於水，不易褪色，電子密度高，最為常用。

· 目前已經有商品化的試劑盒，使用起來非常方便。

(2) 鹼性磷酸酶(AP)及底物

· AP為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應顯色：

– 偶氮偶聯反應，底物為-萘酚磷酸鹽，經水解後得-萘酚，與重氮化合物如堅牢藍(fast blue)或堅牢紅(fast red)形成不溶性沉澱，分別呈蘭色或紅色。

– 靛藍-四唑反應：底物為溴氯羥吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，經酶水解並氧化形成靛藍，而氮藍四唑(NBT)在此氧化過程中被還原成不溶性紫蘭色沉澱。

2、常用的免疫酶染色方法

· 又分為以下兩種方法：

– 酶標抗體法

· 直接法

· 間接法

– 非標記抗體酶法

· 酶橋法

· PAP法

(1) 酶標抗體法

· 通過共價鍵將酶結合在抗體上，製成酶標抗體，與標本進行反應後，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。

– 優點：切片能長期保存、反覆觀察，適於鏡下半定量分析。

– 缺點：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產生非特異染色。

(1) 酶標抗體法——直接法

· 將酶直接標記在一抗上，然後直接與相應抗原特異地結合。形成抗原-抗體-酶複合物，最後用底物顯色劑顯色。

(1) 酶標抗體法——間接法

· 將酶標記在二抗上，先將一抗與相應的抗原結合，形成抗原抗體複合物，再用二抗(酶標抗體)與複合物中的特異抗體結合，形成抗原-抗體-酶標抗體複合物，最後用底物顯色劑顯色。

酶標抗體間接法的操作步驟

· 標本準備：

– 石蠟脫蠟至水；

– 冰凍切片浸入4C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；

– 細胞爬片先用PBS洗，然後4C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；

· 石蠟切片需要進行抗原修復，其它標本則不用；

(2) 酶標抗體間接法的操作步驟(續)

· 封閉內源性過氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育5～10min (濕盒內) ；

· 0.01M PBST漂洗，5min×3；

· 5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min (濕盒內) ；

· 傾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配製)稀釋的一抗， 37C孵育60min 或4C過夜(濕盒內)；

(2) 酶標抗體間接法的操作步驟(續)

· 0.01M PBST漂洗，5min×3；

· 加HRP標記的二抗室溫孵育lh或37C 30min ；

· 加0.01%H2O2~0.05%DAB顯色 (顯色液應新鮮配置)；

· 經PBS漂洗3次後，梯度酒精脫水，二甲苯透明，明膠甘油封片，顯微鏡觀察。

(2) 非標記抗體酶法——酶橋法

· 首先用酶免疫動物，製備效價高、特異性強的抗酶抗體；

· 以二抗作橋，將抗酶抗體聯結在一抗上；

· 再將酶結合在抗酶抗體上，經顯色顯示抗原的分布

– 優點：任何抗體均未被酶標記。酶是通過免疫學原理與酶抗體結合的。避免了共價連線對抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節省一抗的用量。但抗酶抗體不易純化。

幾點說明

· 一抗(假設來自種屬A)的稀釋度可大些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結合。

· 二抗——橋抗體(抗種屬A的IgG抗體)應過量，使其Fab段一個與一抗結合，另一個則游離。

· 因抗酶抗體與一抗均系種屬A IgG，具有相同的抗原性，所以橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結合，起橋作用，將其連線在與組織抗原結合的一抗上。

(2) 非標記抗體酶法——PAP法

· 與酶橋法相似，不同的是，PAP法將酶橋法的第3、4步並為1步，用PAP複合物代替;

· PAP是離體製備的複合物(HRP--抗HRP)。

· 顯色與酶橋法相同，PAP複合物中的過氧化物酶催化底物水解，形成不溶性終產物。

PAP法評價

· PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感。特別適用於石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。

– 缺點：步驟較多，時間較長，不適用於臨床常規檢查。

· 由於常做石蠟切片，故可用於回顧性研究。

親和組織化學法

· 是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎。

· 這種方法敏感性更高，有利於微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位。

生物素—抗生物素染色法

【原理】

· 生物素(biotin)又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉氨甲醯基化過程中的輔酶。

· 抗生物素(avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的鹼性蛋白，對生物素具有很強的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個亞基組成，每個亞基都有生物素的結合位點。

· 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質相偶聯，又可被酶類等多種示蹤物所標記，形成生物素-抗生物素系統。

– 該系統一端偶聯大分子生物反應體系，另一端連結標記物，後者加入酶的底物，產生顏色反應。

(1)標記抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分為直接法和間接法。

· 直接法

用生物素標記第一抗體，與抗原結合；酶標記抗生物素，與生物素結合，然後進行酶呈色反應。

· 間接法

用生物素標記二抗，酶標記抗生物素，先用第一抗體與組織抗原結合，再將第二抗體與第一抗體相連結，最後進行呈色反應。

(2)橋抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB)

– 此法是用生物素分別標記抗體和酶，以抗生物素為橋，把二者連線起來，進行呈色反應。

(3) 抗生物素-生物素-過氧化物酶法

(ABC法)

· ABC法是在BRAB和LAB的基礎上改良的方法。

· ABC複合物是將過氧化物酶結合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應而製備的。

· 分為直接法和間接法。

– 直接法是生物素標記的一抗與ABC複合物結合；

– 間接法是生物素標記的二抗與ABC複合物結合。

ABC法的評價

· 敏感性強：ABC法比PAP法敏感性高20~40倍。

· 特異性強，背景染色淡：由於敏感性高，一抗和二抗都可被稀釋至可能的濃度，減少了非特異染色。

· 方法簡便，節約時間。可由PAP法所需的2天縮短至幾個小時。

· 由於生物素與抗生物素具有與多種示蹤物結合的能力，可用於雙重或多重免疫。