基本介紹
前言,發展介紹,技術分類,標記物,套用,免疫組織化學,
前言
發展介紹
—— 60年代 Nakane建立酶標抗體技術——鐵蛋白標記Ab技術。
—— 70年代 Stemberger 改良上述技術，建立辣根過氧化物酶——抗體過氧化物酶（PAP）技術，使免疫細 胞化學得到廣泛套用。
—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之後，免疫金—銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡 技術相繼問世。
——2000年 各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組化技術成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的 一項有力工具。其套用範圍深達醫學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。
技術分類
（1）根據染色方式分成：① 貼片染色
② 漂浮染色
（2）根據Ag—Ab結合方式分成：
① 直接法
② 間接法
③ 多層法
（3）按標記物的性質分成：
① 免疫螢光技術（免疫螢光法）
② 免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD 法、 ABC法）
③ 免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法）
標記物
（1）必要性：組織細胞內Ag—Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。
（2）常用標記物
四乙基羅達明（rho—damine RB200）——螢光顯微鏡下發橙紅色螢光
② 酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶。
③ 生物素：（Biotin）
④ 鐵蛋白金等：主要套用於免疫電鏡。其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）
套用
凡是組織細胞內具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學方法顯示，因而目前在基礎與臨床科研中被廣泛套用。最近幾年，分子生物學研究異常活躍，但最終還要歸到形態上來。用免疫組織化學方法對所研究的大分子分子進行定位，進而深入研究其功能。
免疫組織化學
染色方法
1．直接法
△ 酶標抗體要顯示後鏡檢。
直接法優點：簡單，時間短，特異性強。 缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經濟）。 套用：基本不用！
2．間接法 螢光素標記在二抗上（二抗：抗產生一抗動物的 IgG抗體）。
※顯色後鏡檢
特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體→ 鑑定多種抗原。
3．非標記Ab橋法：
“橋法”是酶標記抗體的改進，經過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。
（1）單橋法
(2)雙橋法
在三抗之後，將二抗和三抗再重複一次，
可增大染色強度。
★ 特別提示：注意動物種屬關係
4．PAP法（過氧化物酶—抗過氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）
~ 是橋法的改良，既先形成PAP複合物→抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP複合物。
該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。
5．ABC法（親和素—生物素—過氧化物酶複合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC 法）
Avidin： 親和素，一種糖蛋白，其上有4個與生物素相結合的位點。
Biotin ： 生物素—維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。
ABC法與PAP法的區別是：以ABC複合物代替PAP複合物。
（1）ABC複合物的製備：
（2）ABC法反應原理
6．SP或SAP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵 白素或過氧化物酶標記的鹼性磷酸酶染 色） Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase）
※ 該法是ABC法基礎上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，而後再結合PO 。
它有4個亞基可與生物素結合，靈敏特異， 背景低，成本低。
現在還有plus盒。優點是：更簡便，放大倍數↑，等電點中性更適合組織。分子量小，穿透力↑。
7．蛋白A—金法（Protein—A gold method）
~多用於電鏡
8．雙重組化染色法
9．免疫金—銀染色法
（Immunogold—silver staining IGSS）
固定——見前述
注意事項：
1．固定劑的選擇：因組織而不同，注意質量和
性能。
2．固定方式的選擇：① 浸漬固定（參考文獻）
② 灌注固定（+後固定）
③ 蒸汽固定
免疫組化染色步驟（以ABC法為例）
1．切片脫蠟入水，入PBS 洗三次/15分鐘。
2．封閉內源性過氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 （在PAS或0.05Tris—HCL緩衝液PH7.6中或甲醇中）室 溫，30 分鐘。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分鐘。
4．減少非特異性著色用稀釋20倍的正常血清（產生二次抗體動物血清！），室溫，30分鐘。
5．滴加第一抗體，4℃過液或室溫5′~1 hour。
6．0.1MPBS，洗三次，每次5分鐘。
7．滴加第二抗體，室溫15′~ 60′。
8．0.1MPBS 洗淨，洗三次，每次5分鐘。
9．滴加ABC複合物，室溫15~60分鐘。
10．0.1MPBS 洗三次，每次5分鐘。
11．0.05M Tris –HCL 5~10分鐘，此步可省略。
12．DAB—H2O2 顯色：用0.01%H2O2的DAB溶液，室溫5~30分鐘，隨時鏡檢（DAB用時新配）
13．自來水洗淨。
15．常規脫水、透明、封固、鏡檢。
結果：棕褐色反應產物代表抗原X的定位。
免疫組化染色基本技術及注意事項
1．實驗計畫
① 根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源於鼠，否則不能連線成複合物。
② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼於同一張載片上，否則無可比性。
③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。
2．Ab稀釋度 （如系購買的藥盒有工作液和原液）
（1）工作液：無須稀釋
（2）原液：
① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。
如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；
若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。
② 原液的保存（—20℃）凍存——應選最佳稀度凍存。
③ 若工作濃度大於1∶500則要先將原液稀釋十倍，而後分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）於 冰櫃備用。
④ 關於Ab保存應參照說明書。
（3）Ab濃度的選擇
Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度範圍內進行，若一方過剩則形成複合物小且少；極 過剩時已形成的複合物亦會解體而呈現假陰性。——並非Ab濃度越高越好。
3．Ab滴片技術
—— 所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。
[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄乾，但不能幹片。
要領：甩淨組織周圍的水。
4．PBS洗滌技術
（1）洗滌的目的
① 保證離子濃度和PH值。
② 減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）
（2）方法：洗三次，每次5分鐘。
5．Ab孵育技術
（1）必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發和乾片。
（2）溫度與時間 4℃：過夜；
37℃：2 h or 參考說明書
6．光鏡控制顯色方法
（1）室內操作：注意溫度與時間的關係，室溫最宜5分鐘。
（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片後顏色可加深。
對照組和染色結果的評價
從以下幾 個方面綜合評價：
1．陽性染色特點
① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區別）
② 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）
2．組織切片製作過程的影響
① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。
② 邊緣乾燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿乾片。
3．人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。
陽性對照：
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果，標為陽性對照。
陰性對照：
用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照 還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。
▲ 染色失敗的幾種原因：
（1）所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性 對照在內。全部（－）原因可能：
① 染色未完全嚴格按照操作步驟進行；
② 漏加一種抗體，或抗體失效；
③ 緩衝液內含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；
④ 底物中所加H2O2 量少或失效；
⑤ 復染或脫水劑使用不當
（2）所有切片均呈陽性反應，原因可能是：
① 切片在染色過程中抗體過濃，或乾燥了。
② 緩衝液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不徹底。
③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長。
④ 抗體溫育的時間過長。
⑤ H2O2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。
（3）所有切片背景過深，原因可能是：
① 未加酶消化處理切片。
② 切片或塗片過厚。
③ 漂洗不夠。
④ 底物呈色反應過久。
⑤ 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。
（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因是：標本的固定和處理不當。
