基本介紹
- 中文名：免疫電鏡
- 外文名：immunoelectron microscopy
- 對象：超微結構
- 特點：抗原和抗體定位的研究
原理,影響免疫電鏡的一些因素,免疫電鏡技術的操作程式,抗體的製備,標本的處理,取材,固定,常用的免疫電鏡標本固定液,固定方法與時間,包埋,免疫標記,包埋前免疫標記,厚切片,增加細胞膜的通透性,選用相對分子質量較小的標記物,包埋後免疫標記,選用低溫包埋劑。,冷凍超薄切片免疫標記,對照實驗,結果的觀察和解析,
原理
根據標記方法的不同， 分為免疫鐵蛋白技術、免疫酶標技術和免疫膠體金技術。如免疫鐵蛋白技術是將含鐵蛋白通過一種低分子量的雙功能試劑與抗體結合，成為一種雙分子複合物，它既保留抗體的免疫活性，又具有電鏡下可見的高電子密度鐵離子核心，因此用鐵蛋白標記的抗體可通過電鏡免疫化學的方法在電鏡下定位細胞中的抗原。
影響免疫電鏡的一些因素
1．標記物 用於電鏡觀察的標記物有三類：一類是電子密度緻密的標記物，如鐵蛋白、辣根過氧化物酶等。另一類則是放射性同位素，如I、S、P、C、H等，第三類則是有獨特形狀的標記物，如血蘭蛋白、噬菌體等。對標記物的要求是：具有特定的形狀、不影響抗原抗體複合物的特性與形狀。目前用於免疫電鏡的標記物主要是鐵蛋白和HRP。兩者各有其優點，鐵蛋白電子密度緻密。觀察時反差大，優於酶標記，但鐵蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以適於細胞表面抗原的定位，另外鐵蛋白的標記過程比較複雜。HRP分子量小(40 000)，穿透力強，有利於標記抗體進入細胞內，適於細胞內的抗原定位。
（1）固定劑的要求：①不損害細胞內抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易於滲透；④固定後,不引起交聯，造成空間的阻礙，影響標記抗體進入抗原位。
（2）影響固定的因素有：①採用固定劑的種類；②固定劑的濃度，濃度過大，對抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；③固定劑的pH；④固定劑的溫度,一般採用2℃～4℃冷固定；這樣能降低細胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定時間與溫度有關，溫度高，固定快，也與緩衝系的離子強度有關，離子強度大，滲透壓大，穿透力強，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時間也不一致；⑥與被固定的細胞類型有關。目前常用的固定系統有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛+1%戊二醛，4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛，96%乙醇+1%醋酸。不論採用哪些系統，使用前必須用已知效價的抗原做一系列預實驗。如固定劑的種類濃度、溫度、pH及固定時間等。然後做出預處理的效價，作為失活參考以再選擇最適條件。
例如由於某些固定技術（如鋨酸固定）對抗體抗原的結合有干擾，因此應採取較為溫和的樣品製備方法。
3．非特異性吸附 非特異性吸附與酶標抗體、抗血清的稀釋度、染色時間，溫度及介質等有關，其中最主要的是抗血清及標記抗體的稀釋。一般認為高效價抗血清或標記抗體稀釋到低蛋白濃度，用於標記染色可獲得最理想的結果。因為低蛋白濃度有利於降低非特異性吸附。實際套用的蛋白濃度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。工作效價一般在1︰20～1︰400,在實際工作中，將標記抗體或抗血清稀釋到1︰100倍以上則可獲得理想的陽性結果，而非特異性吸附必然降得很低。工作濃度的選擇是將標記抗體或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀釋，做已知陽性標本的標記染色觀察，取其陽性沉積物明顯，而非特異性吸附最低的一稀釋度做為工作濃度。4．標記染色法 標記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點是特異性較高,敏感性低，標記抗體只能用於檢測一種抗原。後者敏感性較強，一種標記抗體可用於多種抗原的檢測。缺點是特異性較差。
免疫電鏡技術的操作程式
抗體的製備，標本的處理，免疫標記，對照實驗、結果的觀察和解析。
抗體的製備
特異性高、親和力強的高效價抗體是獲得理想的免疫標記結果的首要條件要。抗體可購買或自己製備。大分子完全抗原，可直接免疫動物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠來獲得抗體。半抗原，用偶聯劑使半抗原與大分子物質結合成複合物，再去免疫動物產生抗體，大分子物質稱為載體蛋白，以甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白或血藍蛋白最為常用。偶聯劑為戊二醛或碳二醯亞胺等。目前細胞雜交瘤技術製備的單克隆抗體最為理想。
標本的處理
為了既能將抗原準確定位甚至定量，又能觀察到近似於生活狀態下的細胞超微結構，必須選擇合適的固定劑，慎重處理樣品。
取材
單細胞：培養細胞或血細胞應隨用隨取。懸浮培養細胞可先離心(800 rpm，5 min)，用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗1次後進行固定。貼壁細胞則可先將其培養在玻片上，用PBS輕輕沖洗後立即固定，也可用胰酶將細胞消化下來，按懸浮培養細胞的製備方法製備。
組織：取組織塊時做到越快越好，最好在沒有停止血流前就取材。若觀察的對象為肺、大腦、脊髓或內分泌器官等比較柔軟的組織，應先做灌注固定，再用銳利的刀片將其切成約2 mm×2 mm×l mm大小的組織塊，切時要避免擠壓與牽拉，然後投入到固定液中繼續固定。
固定
固定劑常會對抗原的活性產生不同程度影響，為了保存細胞的超微結構和抗原的活性，應通過預試驗，確定固定劑的種類、濃度、溫度、pH及固定時間和方式，可用已知效價的抗原進行試驗，選擇合適的固定方法。
常用的免疫電鏡標本固定液
多聚甲醛-戊二醛固定液(簡稱PG)：1%多聚甲醛對組織細胞的抗原性影響不大，若加入超過0.1%戊二醛，抗原性就會迅速減弱;當戊二醛的濃度低到0.01%～0.05%時，對抗原性的影響便不顯著，而細胞超微結構的保存也可獲得很大改善。所以推薦用1%多聚甲醛加0.01%～0.05%戊二醛作為免疫電鏡標本的固定劑，固定時間為4～5 h。對有些抗原性較強的標本，也可採用4%多聚甲醛加0.05%～0.5%戊二醛進行固定。某些抗原對戊二醛極其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定會造成抗原提取或移位，同時醛類等交聯固定劑會改變蛋白質分子的結構而影響其抗原性，所以在不明顯影響抗原性的前提下，選擇合適的固定濃度和時間，儘可能強一些為好。
過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛混合固定液(簡稱PLP)：PLP液含0.01 mol/L過碘酸鈉、0.075mol/L賴氨酸、2%多聚甲醛及0.037mol/L磷酸緩衝液。其機制是藉助過碘酸鹽氧化抗原，一般為糖蛋白的糖類部分，使其羥基變為醛基，這樣賴氨酸的雙價氨基就能與醛基結合從而把抗原交聯起來。由於大多數組織抗原含蛋白質與糖類，抗原決定簇位於蛋白部分，該固定劑有選擇性地固定糖類，這樣既穩定了抗原，又不影響抗原決定簇與抗體的結合。加入低濃度的多聚甲醛則能穩定蛋白與脂類。因為賴氨酸價格較貴，此固定液不如PG固定液經濟。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液(簡稱PAPG)：PAPG液含4%多聚甲醛、15%(V/V)苦味酸、0.5%戊二醛、pH為7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影響抗原活性的前提下固定蛋白質，改善對膜和胞質的保存。特別是不能採用高濃度的戊二醛與鋨酸做後固定時(如包埋後的免疫標記)，在前固定液中加入苦味酸對超微結構的保存有很大幫助。
固定方法與時間
灌注固定：這是固定效果最好的方式，能使超微結構得到很好的保存。以大鼠為例，麻醉後，用注射針頭經左心室向主動脈灌注固定液，靜脈壓為120mm Hg柱，在5～15 min內每200g體重灌注150 ml固定液。
浸沒固定：將手術或灌注後切成的標本塊浸沒在固定液中固定，浸沒固定時間常為2～5h，游離細胞固定0.5～1h。
包埋
包埋劑類型：環氧樹脂包埋劑和低溫包埋劑。
包埋前免疫標記：即對已固定的樣品先進行免疫標記，然後進行包埋、超薄切片並觀察結果，一般選用環氧樹脂包埋劑。環氧樹脂本質是疏水性的，在包埋前樣品必須先進行完全脫水，然後在溫箱中進行熱聚合。熱聚合會使大多數抗原變性，因此該包埋劑不適用於包埋後免疫標記。
包埋後免疫標記：指組織標本經固定及樹脂包埋，製作成超薄切片後再進行免疫化學標記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRGold包埋劑。這三種包埋劑均能在低溫下(-35℃～-80℃)用紫外光(波長315～360nm)進行聚合，避免了高溫對抗原性的負面影響，提高了陽性標記率，而且對膠體金的非特異性吸附少，對溫度敏感的抗原應選擇使用低溫包埋劑。
免疫標記
根據免疫標記與標本包埋之間的不同關係，可分為包埋前免疫標記、包埋後免疫標記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標記。根據具體的標本、抗原的部位及性質並結合實驗室的具體條件選擇恰當的方法。這三種免疫標記方法，都包括非特異性位點的封閉、抗體與抗原特異性結合的免疫反應、反應部位的示蹤顯示等基本步驟。
包埋前免疫標記
優點一是切片在免疫標記前不經鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，抗原活性不會受到上述過程的影響，而且抗原暴露充分，標記的陽性率高，非特異性反應少。二是免疫標記後還可進行半薄切片，在免疫反應陽性部位做定位超薄切片，進一步提高電鏡的檢出率。三是免疫標記完畢後，用戊二醛與鋨酸再次固定組織，可使抗原抗體的結合更加牢固，並有利於膜結構的保存。
包埋前免疫標記主要用於細胞膜表面抗原的免疫定位，以及用於某些易被脫水劑和樹脂成分溶解和變性的抗原的檢測。包埋前免疫標記細胞內抗原受到標記抗體的穿透性限制，為了提高對細胞內抗原的標記率可以採取以下措施：
厚切片
厚切片進行包埋前免疫標記，需將固定後的組織厚切片(單細胞團不需厚切片)，以利於標記抗體的穿透。厚切片的方法有以下幾種：
冰凍切片：用恆冷箱冰凍切片機將固定後的組織塊切成8μm左右的厚片。將切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶內備用。也有的將厚片直接貼在載玻片上進行免疫標記，這樣做雖然操作比較方便，但因抗體只能與厚片的一面接觸，所以會在一定程度上影響標記的陽性率。
震動切片：震動切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫電鏡用只需20μm～80μm的切片。震動切片的優點是可以避免冰凍對組織帶來的損害，但它切出來的切片過厚，即使在使用穿透劑的條件下，免疫試劑也僅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深層的組織就不易被標記。
增加細胞膜的通透性
用0.01%Saponin或0.1%Triton X-100等活性劑處理5～8min，以增加細胞膜的通透性。但這些化學物質會對超微結構產生一定程度的破壞，所以應根據不同的組織或細胞，嚴格控制活性劑的套用濃度與時間。也可用凍融的方法增加細胞膜通透性，標本先進行防冰晶處理(厚片在含15%甘油、20%蔗糖的PBS中振搖沉底)，在液氮中速凍0.5～1min後用PBS迅速回溫。
選用相對分子質量較小的標記物
辣根過氧化物酶與IgG的Fab片段交聯物，分子質量較小，約100kD，較易進入細胞內。也可用IgG Fab-lnm金作為標記物，標記後經銀加強染色的納金包埋前標記法。由於該標記物較易穿透到組織和細胞內，且定位比酶標抗體精確，因此被廣泛用於膜受體的精確定位。
包埋後免疫標記
包埋後免疫標記具有超微結構保存較好、方法簡便可靠、陽性結果重複性高的優點，可對同一組織塊的連續切片做各種對照免疫標記，能十分準確地解釋免疫標記結果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫標記，尤其適合於顆粒性標記物(膠體金標記)的免疫化學定位標記，是目前套用最廣的免疫電鏡技術。但是該方法也有明顯的缺點，抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，且抗原被樹脂遮蓋不易與抗體接觸，使免疫標記的陽性率下降。尤其是後固定劑鋨酸對抗原的破壞較嚴重，因此常常避免使用。為了得到精細的超微結構並提高陽性標記率，必須注意以下幾個方面：
通過預實驗確定合適的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到較好的超微結構。固定液一般不用四氧化鋨，因其會使抗原活性明顯降低。
選用低溫包埋劑。
免疫電鏡用載網要選用鎳網或金網，而不用銅網，因銅網會與某些化學物質產生反應而影響標記結果。
冷凍超薄切片免疫標記
冷凍超薄切片免疫電鏡技術的特點是組織不經脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態下進行超薄切片，然後進行免疫標記。該項技術克服了上述兩種方法的缺點，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標記的敏感性，但在冷凍過程中超微結構會受到冰晶的破壞。1996年，LiouW等改良了冷凍超薄切片技術，用甲基纖維素和醋酸鈾混合液(含1.5%～2%甲基纖維素，0.3%～3%醋酸鈾的水溶液)代替傳統的蔗糖溶液作為將冷凍切片從冷凍槽中轉移到鎳網上的溶液，得到了保存良好的超微結構，使該項技術更加完美，套用也越來越廣泛。但該項技術必須有特殊的冷凍超薄切片機，且技術難度較高。
對照實驗
為了證實免疫標記結果的特異性，必須同時進行對照實驗。在抗體的特異性無問題的前提下，對照實驗有以下幾種：
用未經免疫的同種動物正常血清代替第一抗體，結果應為陰性。 不加一抗，結果應為陰性。 用不含有靶抗原的標本進行免疫標記，結果應為陰性。 對肯定含有靶抗原的標本進行免疫標記，結果應為陽性。
結果的觀察和解析
在電鏡下觀察免疫標記的結果，通過標記物(膠體金、鐵蛋白或酶底物)顯示免疫反應部位以定位抗原的存在位置，注意區分特異性標記和背景的非特異性標記，進行正確的結果分析
